血管內皮生長因子及其受體在子宮內膜異位癥中的表達和意義①

王春紅 魏靜波 曲銀娥 田艷霞 薛素萍

(河北聯合大學基礎醫學院組織胚胎學系，唐山063000)

子宮內膜異位癥(Endometriosis，內異癥)為子宮外子宮內膜樣組織異常增生，是育齡婦女的常見病、多發病，發病率呈逐年上升趨勢［1］。內異癥雖為良性疾病，卻具有惡性疾病的生物學行為，易發生組織侵襲及遠處轉移。新生血管形成是內異癥發生的關鍵步驟和必備條件，異位內膜本身及其周圍新生組織血供的建立和維持是子宮內膜異位種植存活和組織侵襲及轉移發展的基本條件。血管內皮生長因子(VEGF)是目前公認最重要的促血管生成因子［2］，必須與其受體結合才能發揮其相應的作用，VEGFR1是絡氨酸激酶受體［3］，屬VEGF受體成員之一。本研究采用免疫組化及Western blot方法檢測VEGF及其受體VEGFR1在異位癥在位及異位內膜的表達及定位，探討VEGF/VEGFR1在內異癥發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2011年9月至2012年9月河北省唐山市婦幼保健醫院收治的經開腹或腹腔鏡手術的內異癥患者34例，排除同時合并內異癥、子宮腺肌癥和子宮肌瘤者，年齡(36.0±1.43)歲，同時刮取在位內膜及異位內膜，其中增生期14例，分泌期20例。另選取同期內34例行絕育手術或患子宮肌瘤等良性病變需手術的患者作為對照組，均排除患有內異癥，(38.2±2.13)歲，其中增生期16例，分泌期18例。所有入選對象術前3個月內未接受放療、化療、激素治療及手術治療，無其他腫瘤病史及全身性疾病。所取組織均經病理學診斷，并依據HE染色及月經周期分為增生期和分泌期。

1.2 標本采集與方法 患者知情同意前提下，術中取子宮內膜組織標本，保留子宮者于術前或術中刮取子宮內膜組織，切除子宮者切取子宮內膜組織，腹腔鏡術中留取卵巢子宮內膜異位囊腫囊壁組織，所取標本經生理鹽水沖洗后，部分入液氮冷卻30分鐘后，置-80℃冰箱中保存備用，部分經4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 μm連續切片。

1.2.1 主要試劑 兔抗人VEGF單克隆抗體、VEGFR1多克隆抗體、GAPDH單克隆抗體分別購自北京中杉金橋生物技術有限公司、Abcam公司及Sigma公司，兔即用型免疫組化試劑盒購自北京四正柏科技生物有限公司;BCIP/NBT顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2.2 免疫組織化學染色 SP法檢測各組內膜組織中VEGF及VEGFR1蛋白表達，步驟如下:(1)切片常規脫蠟至水，微波90秒修復抗原，3%H2O2孵育10分鐘以消除內源性過氧化物酶，滴加正常山羊血清封閉20分鐘;(2)滴加一抗，VEGF及VEGFR1工作濃度均為1∶100，濕盒4℃孵育過夜;(3)滴加生物素化山羊抗兔二抗，濕盒37℃孵育30分鐘;(4)滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，濕盒37℃孵育20分鐘;(5)PBS洗5分鐘×4次，DAB顯色，自來水終止顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察。同時以PBS液代替一抗作為陰性對照。

結果分析:高倍鏡下，每張切片隨機選取10個包含子宮腺的視野，采用顯微成像系統拍照，利用Image-pro-plus圖像分析軟件對圖片進行分析，分別測量EMs組異位內膜、在位內膜與對照組陽性細胞的平均光密度(MOD)值，代表蛋白表達量，計算各組的平均光密度。

1.2.3 Western blot分析 -80℃冰箱中取出內膜組織，加細胞裂解液冰上勻漿提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。每孔50 μg總蛋白，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質，經電轉印(濕轉)將蛋白質轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2小時，加入相應一抗(抗體工作濃度 VEGF及 VEGFR1為1∶500，GAPDH 為1∶1 000)，4℃孵育過夜。TBST 洗膜3次，加入堿性磷酸酶(AP)標記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育2小時，TBST洗膜3次，置條帶于避光顯色盒中，加入BCIP/NBT顯色液，室溫孵育1～5分鐘，自來水終止顯色，方正掃描儀掃描條帶，Image J軟件對條帶進行分析，以VEGF或VEGFR1與GAPDH條帶的相對吸光度值作為VEGF或VEGFR1蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 VEGF和VEGFR1蛋白在子宮內膜組織中的表達與分布 棕黃色染色為陽性細胞。VEGF、VEGFR1蛋白均主要表達于三組子宮內膜腺上皮細胞胞漿及胞膜，間質細胞中有散在表達(圖1)。

2.2 各組內膜組織中VEGF及VEGFR1蛋白表達水平比較 免疫組化結果顯示:無論增生期還是分泌期，異位癥患者在位內膜及異位內膜VEGF和VEGFR1蛋白表達均高于對照組同期內膜，差異均有統計學意義，而異位癥在位內膜與異位內膜之間差異無統計學意義(圖1，表1)。免疫印跡檢測結果與免疫組化一致(圖2，表1)。

表1 各組內膜VEGF和VEGFR1蛋白比較(MOD，±s)Tab.1 The expression of VEGF and VEGFR1 proteins in each group(MOD，±s)

表1 各組內膜VEGF和VEGFR1蛋白比較(MOD，±s)Tab.1 The expression of VEGF and VEGFR1 proteins in each group(MOD，±s)

Note:Secretory phase vs proliferative phase，1)P ＜0.05;EMs vs control group，2)P ＜0.05.

Groups n Immunohistochemistry Western blot VEGF VEGFR1 VEGF VEGFR1 Proliferative phase Endometrium of control 16 0.078±0.028 0.376±0.068 0.068±0.017 0.287±0.087 Eutopic endometrium of EMs 14 0.682±0.0262) 0.684±0.1102) 0.691±0.1612) 0.697±0.1662)Ectopic endometrium of EMs 14 0.686±0.0222) 0.689±0.0412) 0.685±0.1132) 0.686±0.1312)Secretory phase Endometrium of control 18 0.113±0.0131) 0.414±0.0691) 0.125±0.0121) 0.359±0.0211)Eutopic endometrium of EMs 20 0.689±0.0562) 0.696±0.1672) 0.701±0.1572) 0.704±0.1222)Ectopic endometrium of EMs 20 0.692±0.1152) 0.702±0.1512) 0.698±0.1242) 0.671±0.1272)

2.3 VEGF及VEGFR1蛋白表達與月經周期的關系 免疫組化及蛋白印跡結果均顯示，VEGF和VEGFR1蛋白表達水平在對照組子宮內膜中均為分泌期高于增殖期，差異均有統計學意義，而內異癥在位內膜及異位內膜組織中，VEGF和VEGFR1蛋白增生期及分泌期均為高表達，差異均無統計學意義(圖1、2，表1)，提示內異癥內膜組織中VEGF和VEGFR1蛋白表達失去周期性變化。

圖1 VEGF及VEGFR1蛋白在各組內膜組織中的表達(免疫組織化學，×200)Fig.1 The expression of VEGF/VEGFR1 protein in each group(Immunohistochemistry，×200)

圖2 Western blot檢測結果Fig.2 Results of Western blot

3 討論

子宮內膜異位癥雖為婦科常見的良性病變，但卻有易侵襲和易復發等惡性生物學行為。內異癥的發生、發展涉及很多因素，其發病機理尚不明了。研究表明內異癥的發生、發展有賴于新生血管的形成［4］。血管內皮生長因子(VEGF)是迄今發現的最強促血管生成因子之一，為特異性的內皮細胞有絲分裂劑，能誘導內皮細胞增生，毛細血管袢形成，促進體內新生血管的生成。VEGF單體無生物學活性，但與內皮細胞上的血管內皮生長因子受體1(VEGFR1)有高度的親和力，結合后可作為內皮細胞特異性有絲分裂原發揮促血管生成作用［5］。

本研究發現內異癥患者在位內膜中 VEGF、VEGFR1表達均高于對照組內膜，提示內異癥患者在位內膜存在異常的生物學活性，具有更強的血管生長能力和增殖活性，與Almog等［6］的研究結果相同，支持郎景和的“在位內膜決定論”。VEGF具有促血管形成的功能［7-10］，一方面，VEGF特異性地與內皮細胞上的VEGFR1受體結合，刺激內皮細胞生長，直接參與血管生成;另一方面，當內異癥患者的子宮內膜隨經血逆流入腹腔后，形成最初微小內異癥異位病灶，異位病灶受月經周期調節而周期性生長，卻缺乏在位子宮內膜基底層的血液供應，造成異位病灶組織生長的相對缺氧狀態。缺氧可以誘導細胞產生新的缺氧誘導因子HIF-1α蛋白，而VEGF是HIF-1α重要的靶基因，缺氧機制在基因水平可直接上調VEGF的表達，誘導新生血管的生成［8］。然而新生血管結構不完善，如基膜薄、細胞間缺乏緊密連接等，易發生滲漏和出血，不但不能改善組織缺氧，反而誘發更多的生長因子和新生血管形成，促進內異癥的進一步發展。隨著異位內膜不斷生長，血液供應的相對不足引起異位內膜組織細胞的相對缺氧，缺氧又反饋性地引起VEGF、VEGFR1的表達，循環往復，致使異位內膜不斷侵襲，引起腹腔粘連而導致一系列并發癥。我們前期研究發現內異癥增生期在位內膜及異位內膜HIF-1α和VEGF表達均高于對照組，且 HIF-1α 和 VEGF呈正相關關系［9］。Sharkey等［10］研究也發現缺氧環境能夠調節子宮內膜血管內皮生長因子大量分泌。VEGF通過自分泌途徑刺激自身表達 VEGFR1［11］。Joseph 等［12］實驗證實，血管的發芽與VEGFR1有關，確定血管發芽即新血管生成的位置，VEGFR1即可對VEGF蛋白表達進行調節。VEGF與VEGFR1聯合調控內皮細胞分化、增加微血管通透性［13］，通過引起血漿蛋白的高度通透性而誘導間質產生，促進血管的生長，為異位內膜的生長提供血液供應。同時，VEGF可誘導內皮細胞表達MMPs等多種組織因子和組織蛋白酶，降解細胞外基質，削弱基質的屏障作用，使新生血管基底膜缺損加重，促進血管生長，有利于異位內膜的種植、存活，而異位內膜的生長又可表達更多的VEGF，進一步促進血管增生，形成了一種惡性循環。

綜上所述，內異癥患者在位內膜及異位內膜子宮腺上皮及其基質中高表達VEGF及VEGFR1蛋白，可能通過多種途徑促進異位內膜血管生成，在內異癥的發生發展中具有重要作用。隨著基礎研究的不斷深入，對 VEGF小干擾 RNA、抗 VEGF抗體、VEGF受體拮抗劑及血管生成抑制劑的研究有望為有效阻斷異位病灶遠處種植、侵潤、轉移提供基因治療的新靶點。

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7 Góralczyk B，Smolarz B，Romanowicz H et al.Single nucleotide polymorphisms of VEGF gene in endometriosis［J］.Pol Merkur Lekarski，2012;32(189):151-153.

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10 Sherwin J R，Sharkey A M，Mihalyi A et al.Global gene analysis of late secretory phase，eutopic endometrium does not provide the basis for a minimally invasive test of endometriosis［J］.Hum Reprod，2008;23(5):1063-1068.

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12 Joseph B， Kearney，Nicholas C et al.The VEGF receptor(VEGFR1)is a positive modulator of vascular sprout formation and branching morphogenesis［J］.Blood，2004;103(12):4527-4535.

13 冀 潔，王斌全，張春明et al.血管內皮生長因子受體-1抗體對人喉鱗癌細胞裸鼠移植瘤生長的影響［J］.中國藥物與臨床，2009;9(3):175-177.