miR-150缺失增強小鼠NKT細胞IFN-γ產(chǎn)生并促進小鼠Ⅰ型糖尿病的發(fā)生①

鄭全輝 張愛紅 鄭愛華 陳淑媛 侯志宏 高金明 鄭建興 李 娟

(河北聯(lián)合大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，唐山063000)

NKT細胞是CD1d依賴的自然殺傷性T細胞(CD1d dependent natural killer T cells)，因其細胞表面既表達 TCRα 鏈(小鼠:Vα14-Jα18，人:Vα24-Jα18)和 Vβ 鏈 (小鼠:Vβ8.2，Vβ7，Vβ2，人:Vβ11)，同時又表達 NK 細胞受體如 NK1.1、IL-2/15受體β(CD122)等而命名［1］。在外周免疫器官，NKT細胞特異識別由CD1d分子提呈的糖脂類抗原α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺(α-Galcer)而活化，活化NKT細胞能在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量Th1和Th2型細胞因子如IL-4和IFN-γ，從而在抗感染、自身免疫性疾病及腫瘤治療中發(fā)揮重要的作用［2］。

microRNAs(miRNAs)屬于短鏈非編碼RNAs，長度為20～23nt，通過與靶mRNA 3'端非翻譯區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制其翻譯，負向調(diào)節(jié)靶基因的表達［3］。miR-150是淋巴細胞特異表達的microRNA，Zhou等［4］最早發(fā)現(xiàn) miR-150缺失導(dǎo)致 B細胞異常擴增，體液免疫應(yīng)答顯著增強，但對CD4和CD8傳統(tǒng)T細胞的發(fā)育和功能沒有影響，表明miR-150在不同淋巴細胞發(fā)育和功能中發(fā)揮不同的作用。然而，miR-150在NKT細胞發(fā)育和功能中的作用目前還不清楚。在此研究中，我們采用miR-150基因敲除(miR-150KO)小鼠，發(fā)現(xiàn)miR-150基因缺失不影響外周NKT細胞的數(shù)量，但導(dǎo)致NKT細胞IFN-γ產(chǎn)生增加。在STZ處理糖尿病小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)α-Galcer處理miR-150敲除小鼠與對照WT小鼠相比，糖尿病的發(fā)生顯著提前。以上研究結(jié)果為探索microRNA對NKT細胞功能的影響及其在自身免疫性疾病中的作用提供了新的線索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 小鼠 C57BL/6背景的miR-150基因敲除小鼠(miR-150KO)和野生型對照 C57BL/6小鼠(WT)由Qing-Sheng Mi博士(美國密歇根亨利·福特醫(yī)院)惠贈，并在河北聯(lián)合大學SPF級小鼠房繁殖、飼養(yǎng)。實驗選取4～6周齡、性別匹配小鼠進行研究。小鼠實驗操作按河北聯(lián)合大學實驗動物管理委員會規(guī)定進行。miR-150敲除小鼠基因型鑒定采用下列引物:上游:5-CAAGGACAGGAACCCTTCAGCA-3;下游 5-CCATGATGCCTGGAAGACATTTC-3;miR-150KO小鼠產(chǎn)生262 bp片段，WT小鼠產(chǎn)生866 bp片段。

1.1.2 試劑 MirVana miRNA提取試劑盒和Taq-Man MicroRNA檢測試劑盒購自美國Ambion公司。α-半乳糖神經(jīng)鞘氨醇(α-Galcer)及熒光素標記的CD1d-α-Galcer四聚體購自日本麒麟公司，熒光素標記的抗小鼠 TCR-β(H57-597)、抗 B220(RA3-6B2)、抗 IL-4(11B11)、抗 IFN-γ (XMG1.2)抗體和細胞內(nèi)染色試劑盒購自BD公司，大鼠抗小鼠FcR單克隆抗體(2.4G2)取自 2.4G2雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，IFN-γ和IL-4 ELISA檢測試劑盒購自北京達科為生物技術(shù)公司，鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma，引物由上海生物工程服務(wù)公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 流式細胞儀分析 分別分離小鼠胸腺、脾、肝臟、骨髓和淋巴結(jié)并制成單細胞懸液，用含2%小牛血清的PBS染色緩沖液洗滌兩次，加入2.4G2封閉，4℃ 30分鐘，然后直接加入適當濃度熒光素標記的單克隆抗體，4℃ 30分鐘。染色緩沖液洗滌兩次，采用BD-LSRⅡ流式細胞儀收集標本，CellQuest Pro(BD Biosciences)軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 NKT細胞活化及細胞內(nèi)染色分析 將α-Galcer首先溶于二甲基亞砜(DMSO)，終濃度為100 μg/ml。取 2 μg α-Galcer 于 100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中，經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，溶劑對照采用相同劑量DMSO。4小時后分離小鼠脾細胞，1×紅細胞裂解液處理去除紅細胞，取2×106細胞/樣品重懸于RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，10 mmol/L HEPES，50 mmol/L 2-巰基乙醇)，同時加入 GolgiStop，37℃培養(yǎng)2小時。細胞(1×106/100 μl)首先經(jīng)細胞表面染色，冷PBS洗滌后加入新鮮配置固定/透膜液(1∶3稀釋)0.5 ml，4℃避光孵育30～60分鐘。加入2 ml 1×固定/透膜液洗滌一次，加入2.4G2 4℃封閉15分鐘，直接加入抗小鼠IFN-γ和IL-4抗體進行細胞內(nèi)染色，4℃避光孵育30分鐘，2 ml 1×固定/透膜液洗滌兩次，流式細胞儀分析。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) 采用結(jié)合緩沖液(0.1 mol/L Na2HPO4，pH9.0)稀釋抗小鼠 IL-4和 IFN-γ 抗體至 2 μg/ml，100 μl/孔 加 入相 應(yīng)ELISA板，4℃包被過夜。移除包被液，加入封閉緩沖液(1%BSA)，200 μl/每孔，室溫 2小時。PBS/Tween20洗滌3次后加入1∶50稀釋的α-Galcer處理小鼠血清和倍比稀釋標準血清，100 μl/每孔，室溫4小時。PBS/Tween20洗滌3次后加入底物顯色，450 nm處測量吸光度(OD)。

1.2.4 小鼠糖尿病模型制作及α-Galcer處理 鏈脲佐菌素(STZ)溶于0.1 mol/L pH4.4的枸櫞酸鹽緩沖液，選擇雄性野生型C57BL/6和miR-150KO小鼠，STZ 65 mg/kg腹腔注射，連續(xù)注射5日，STZ注射當天分別注射α-Galcer，100 μg/kg，每3天注射1次，連續(xù)注射3次。STZ注射2周后，取鼠尾血檢測血糖，每周測量1次，連續(xù)測量6周。小鼠糖尿病判斷標準為血糖濃度大于12 mmol/L。

1.2.5 實時定量 RT-PCR 采用 Ambion mirVana miRNA提取試劑盒分別提取WT和miR-150KO小鼠胸腺及脾臟細胞總RNA，采用TaqMan MicroRNA檢測試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，以snoRNU202作為內(nèi)參照。PCR擴增產(chǎn)物檢測采用ABI 7900 Real-time PCR system進行。結(jié)果分析采用^CT值，并計算相對表達。

1.3 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 5或Microsoft Excel統(tǒng)計軟件，結(jié)果采用±s表示，組間差異采用雙尾Student's t檢驗，P＜0.05為組間有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 MiR-150敲除不影響小鼠外周NKT細胞的數(shù)量 基因鑒定結(jié)果表明，miR-150KO小鼠基因型正確(圖1A);Real-time PCR結(jié)果顯示 miR-150在miR-150KO小鼠中的表達顯著降低(圖1B)。采用抗-B220 抗體、抗-TCR-β 抗體和 CD1d-α-Galcer三染色，流式分析NKT細胞在miR-150KO小鼠外周免疫器官的數(shù)量變化，發(fā)現(xiàn)miR-150KO小鼠除在淋巴結(jié)NKT細胞的百分率和細胞數(shù)量顯示增加的趨勢，在NKT細胞分布的主要免疫器官如脾臟、骨髓和肝臟，miR-150KO小鼠與WT小鼠相比，NKT細胞的百分率和細胞數(shù)量沒有顯著變化(圖1C、D)。

圖1 miR-150敲除小鼠外周免疫器官NKT細胞數(shù)量變化Fig.1 NKT cell number changes in the peripheral lymph organs in miR-150KO mice

圖2 miR-150KO小鼠NKT細胞IFN-γ產(chǎn)生增加Fig.2 Increased IFN-γ production in the α-Galcer activated NKT cells in miR-150 KO mice

圖3 miR-150敲除促進α-Galcer處理小鼠糖尿病的發(fā)生Fig.3 miR-150 deletion significantly accelerates the occurrence of diabetes in α-Galcer treated mice

2.2 miR-150KO小鼠NKT細胞IFN-γ產(chǎn)生增加分別給miR-150KO和WT小鼠注射NKT細胞特異激活劑α-Galcer，采用細胞內(nèi)染色和ELISA檢測脾臟NKT細胞和血清中IFN-γ和IL-4的產(chǎn)生和分泌。細胞內(nèi)染色結(jié)果表明，α-Galcer體內(nèi)刺激4小時后，與WT小鼠相比，miR-150KO小鼠IFN-γ和IL-4產(chǎn)生NKT細胞均有增加，其中IFN-γ產(chǎn)生NKT細胞的增加尤為顯著(P＜0.01，圖2A、B)。與細胞內(nèi)染色結(jié)果一致，ELISA結(jié)果顯示，miR-150KO小鼠血清中IFN-γ的量顯著增加(圖2C)。

2.3 miR-150敲除促進α-Galcer處理小鼠糖尿病的發(fā)生 為觀察miR-150敲除NKT細胞對胰島素依賴性糖尿病發(fā)生和發(fā)展的影響，miR-150KO和WT小鼠分別注射STZ，制備Ⅰ型糖尿病小鼠模型，同時給予α-Galcer處理活化NKT細胞，試劑對照采用等量DMSO注射。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α-Galcer處理miR-150KO小鼠在STZ注射3周后出現(xiàn)糖尿病，發(fā)病率為12.5%，第5周時糖尿病的發(fā)病率達50%，至第7周時，所有miR-150KO小鼠均發(fā)生糖尿病。而α-Galcer處理WT小鼠在STZ注射4周時仍無糖尿病發(fā)生，到第5周時糖尿病發(fā)生率僅為12.5%，至第7周時，α-Galcer處理 WT小鼠糖尿病發(fā)生率為62.5%(圖3A、B)。與α-Galcer處理組相比，DMSO處理組miR-150KO和WT小鼠糖尿病的發(fā)病時間及發(fā)病率沒有顯著性差異(圖3C、D)。

3 討論

NKT細胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個保守的T細胞亞群，起源于胸腺CD4+CD8+雙陽性T細胞。大部分NKT前體細胞在經(jīng)歷 CD44－NK1.1－，CD44+NK1.1－和 CD44+NK1.1+三個發(fā)育階段后成為成熟NKT細胞，然后進入肝臟、脾臟、骨髓和淋巴結(jié)等外周免疫器官，其中，脾臟和肝臟NKT細胞的分布最為豐富。另外，在CD44+NK1.1－發(fā)育階段，一部分非成熟NKT細胞離開胸腺直接進入外周免疫器官并進一步發(fā)育成熟［5］。我們以往的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-150缺失引起小鼠胸腺NKT細胞數(shù)量減少，細胞發(fā)育受阻于 CD44+NK1.1－階段［6］。在此研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-150KO與對照WT小鼠相比，外周NKT細胞的數(shù)量并沒有顯著變化，提示miR-150KO小鼠可能有更多的CD44+NK1.1－發(fā)育階段NKT細胞自胸腺進入外周發(fā)育。與Savage等研究結(jié)果一致［7］，非成熟 CD44+NK1.1－NKT 細胞趨于進入淋巴結(jié)，與WT小鼠相比，miR-150KO小鼠淋巴結(jié)NKT細胞數(shù)量增加明顯(圖1C、D)。

NKT細胞的一個顯著特征是在受到TCR信號刺激時，能在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量Th1和Th2型細胞因子，進而發(fā)揮強大的免疫調(diào)節(jié)功能。在此實驗中，我們發(fā)現(xiàn)miR-150實際上有負向調(diào)控NKT細胞的功能，細胞內(nèi)染色結(jié)果表明，TCR活化miR-150敲除小鼠NKT細胞IFN-γ產(chǎn)生顯著增加，同時IL-4的產(chǎn)生也顯示增加的趨勢;ELISA結(jié)果顯示，α-Galcer處理miR-150KO小鼠與相應(yīng)處理WT小鼠相比，血清IFN-γ的量也顯著增加，進一步證實miR-150主要負向調(diào)控NKT細胞IFN-γ的產(chǎn)生和分泌。不容否認的是，活化NKT細胞可能進一步通過調(diào)節(jié)其它細胞的細胞因子產(chǎn)生和分泌，從而間接改變血清中IL-4和IFN-γ的含量，如IFN-γ可進一步活化NK和Th1 細胞，從而產(chǎn)生更多的 IFN-γ［8］。

TCR活化NKT細胞既能通過其產(chǎn)生和分泌的Th1細胞因子如IFN-γ和TNF-α增強細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，也能通過Th2細胞因子發(fā)揮免疫抑制細胞的作用。盡管多數(shù)研究表明，NKT細胞特異激活劑α-Galcer抑制多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展，但也有相反的報道［9，10］。鏈脲佐菌素(STZ)是誘導(dǎo)糖尿病動物模型的常用藥物之一，多次、小劑量STZ注射通過逐步對胰島β細胞產(chǎn)生損傷而最終導(dǎo)致Ⅰ型糖尿病，與臨床Ⅰ型糖尿病的發(fā)病過程相似。在此研究中，我們發(fā)現(xiàn)與WT小鼠相比，miR-150敲除不但顯著增強了小鼠NKT細胞IFN-γ的產(chǎn)生，而且加速了α-Galcer處理小鼠糖尿病的發(fā)生。研究表明，IFN-γ作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，單獨或與其它細胞因子相互作用，在Ⅰ型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。文芳等［11］體外分離培養(yǎng)SD大鼠胰島細胞，分別或共同加入IL-1β和IFN-γ處理，發(fā)現(xiàn)IFN-γ能顯著抑制胰島素分泌，促進胰島細胞凋亡;Gysemans等［12］發(fā)現(xiàn)IFN-γ 與IL-1β 和TNF-α相互作用，通過活化JAK激酶-STAT1信號通路誘導(dǎo)胰島 β 細胞凋亡;另外，McKenzie等［13］觀察到IFN-γ激活細胞毒性T細胞(CTL)，通過釋放顆粒酶或Fas/FasL信號，促進胰島β細胞凋亡，加速Ⅰ型糖尿病的發(fā)生。因此，在miR-150KO糖尿病小鼠模型中，α-Galcer處理加速小鼠糖尿病的發(fā)生與其IFN-γ產(chǎn)生和分泌增加密切相關(guān)。然而，miR-150如何調(diào)控NKT細胞IFN-γ的產(chǎn)生和分泌，以及在miR-150KO小鼠中，IFN-γ通過何種分子機制加速STZ處理小鼠糖尿病的發(fā)生或發(fā)展目前仍不清楚，有待進一步深入研究。

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