糧谷中8種痕量真菌毒素的定量分析方法

曹 婭，孫 利，王明林，馮 峰，儲曉剛*

(1.山東農業大學 食品科學與工程學院，山東 泰安 271018;2.中國檢驗檢疫科學研究院 食品安全研究所，北京 100123)

真菌毒素是200多種真菌產生的次代謝的有毒物質，可分為鐮刀菌屬、曲霉菌屬、青霉菌屬3種，能夠在寬泛的氣候條件下，生長于田間或者貯藏過程中的農作物上［1］。真菌毒素是一類分子量小于700的有毒化合物質，存在于食品和飼料中，其一方面直接導致農產品腐敗變質、營養物質損失以及產品的品質降低等［2－4］，另一方面通過對任何動物機體內DNA、RNA、蛋白質和各種酶類的合成抑制以及對細胞結構的破壞而引起真菌毒素中毒，真菌毒素對任何動物的毒性都很高，通過吸入及皮膚接觸或攝入被污染的食物，可引起動物病理變化和生理變態，引發包括中毒性肝損害、干細胞毒性、生殖紊亂、遺傳毒性、致癌作用、致畸作用和免疫抑制等中毒癥狀［5－6］。

當前，針對真菌毒素常用的分析方法主要有薄層層析色譜法［7］、氣相色譜法［8］、液相色譜法［9］、氣相色譜串聯質譜法［10］、液相色譜串聯質譜法［11－14］和酶聯免疫吸附法［15］。薄層層析色譜法精確度低、操作較為復雜，近年來的應用受到限制。免疫親和柱的價格昂貴，同時由于其高特異性的特點，無法進行多殘留檢測。而氣相色譜法和氣相色譜串聯質譜法檢測的范圍較窄，僅限于沸點較低的真菌毒素(如單端孢霉烯和棒曲霉素等)。液相色譜的應用范圍雖然廣泛，但檢測的準確度與靈敏度相對于液相色譜串聯質譜法較低，可能產生假陽性結果。因此，多選擇性、高靈敏度的液相色譜串聯質譜法成為近年來真菌毒素檢測的主要分析方法。

為了去除基質干擾，提高方法的靈敏度，前處理方法的優化必不可少。目前用于糧谷中真菌毒素的常規前處理方法有固相萃取法(SPE)［16］、液液萃取法(LLE)［17］等。但很少加入內標對方法進行校正定量分析。本方法的基質是糧谷，雜質較多，干擾較大，而真菌毒素由于性質各異，在前處理過程和電離過程中的損失需要用同位素內標來校正［18］。本實驗應用高效液相色譜法－串聯四極桿質譜技術，通過優化前處理方法和色譜質譜條件，首次建立了糧谷中8種真菌毒素的同位素內標稀釋定量法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀(Agilent公司)，串聯API 5000三重四極桿質譜儀(Applied Biosystem公司)，渦旋混合儀(Scientific Industries公司)，KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，Avanti J-26 XPI離心機(Beckman Coulter公司)。

乙腈(HPLC級，Merck公司)，正己烷(HPLC級，Honeywell公司)，標準品(黃曲霉毒素B1，黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、柄曲霉素和異煙棒曲霉素 C)及同位素內標(黃曲霉毒素B113C17、黃曲霉毒素B213C17、黃曲霉毒素G113C17、黃曲霉毒素G213C17、伏馬毒素B113C34、伏馬毒素B213C34、柄曲霉素13C18和異煙棒曲霉素13C22)均購于Biopure公司，實驗用水均為超純水，電阻率大于18.2 MΩ·cm(Millipore公司)。

標準品黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、柄曲霉素和異煙棒曲霉素C用乙腈溶解，配成50 μg/L的儲備液;伏馬毒素B1和伏馬毒素B2用乙腈－水溶解，配成500 μg/L的儲備液;同位素內標的儲備液配制方法同上。最后用乙腈－水溶液逐級稀釋標準品及同位素內標，配制濃度依次為200、100、50、20、5、1 μg/L的工作液，置于4℃冰箱冷藏。

1.2 樣品前處理

稱取研磨好的糧谷樣品1.0 g(精確至0.01 g)置于50 mL離心管中，加入濃度為20 μg/kg的混合同位素內標，再加入5 mL正己烷和5 mL 60%乙腈，渦漩10 s，超聲5 min，在10 000 r/min的轉速下離心5 min，取1 mL乙腈水層樣液過0.2 μm的濾膜，待分析。

1.3 色譜－質譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18(1.8 μm，2.1 mm×100 mm);柱溫為25℃;流動相A為0.1%乙酸，B為甲醇，流速為200 μL/min，梯度洗脫程序:0～20 min，50%～5%A;進樣體積為5 μL。

電噴霧離子源(ESI):正離子模式;毛細管電壓:5.5 kV，氣簾氣:30 psi;霧化氣(Gas1):60 psi;輔助氣(Gas2):50 psi;離子源溫度:550℃。采用MRM多反應監測方式，母離子/子離子對均設為單位分辨，各參數見表1。

表1 ESI模式下各化合物的質譜條件Table 1 MS/MS conditions in ESI mode for the detection of target compounds in standard solution

(續表1)

2 結果與討論

2.1 樣品前處理的優化

目標樣品糧谷含有油脂類化合物，采用液液萃取的方式可將極性較強的真菌毒素萃取出來。實驗對比了乙腈、甲醇、水、乙腈水和甲醇水的萃取效果，在相同的樣品中加入最大濃度為10 μg/kg的混合標準溶液，結果顯示當以乙腈水作為提取溶劑時效果最好。為了保證目標化合物的萃取回收率，本實驗對乙腈水的混合比例以及不同的超聲萃取時間進行了比較，在空白樣品中加入最大濃度為10 μg/kg的混合標準溶液，按照“1.2”步驟處理，HPLC－MS/MS檢測分析。如圖1所示，當乙腈與水的比例為6∶4時，8種真菌毒素的回收率最佳。由于各化合物極性差別較大，特別是伏馬毒素極性較大，提取溶劑中需含有適量的水，因此實驗選擇乙腈 ∶水(6∶4)為最佳萃取溶劑。進一步考察了萃取時間對萃取效率的影響。結果顯示，多數化合物的回收率隨著超聲時間的延長而提高，但當萃取時間大于5 min后，回收率提高不明顯，而延長萃取時間也會產生熱使得化合物分解或產生其他變化，綜合考慮后選擇超聲萃取時間為5 min。

圖1 不同乙腈與水的比例下8種真菌毒素的回收率Fig.1 Recoveries of 8 types of mycotoxin in vary ratio of acetonitrile to water solvent

2.2 色譜條件的優化

由于電噴霧質譜是在溶液狀態電離，因此流動相的組成除了影響分析物的保留時間和峰形外，還會影響分析物的離子化效率，從而影響目標化合物的檢測靈敏度。本實驗對于流動相中不同有機溶劑(乙腈和甲醇)的種類進行了考察，結果顯示當甲醇作為有機相時各化合物的峰形良好，離子化效率高于乙腈，因此有機相確定為甲醇。

考察了流動相A的pH值在3.3～6.5范圍時對各化合物的離子化影響，結果如圖2所示，當pH值為3.3時，各化合物響應較高，因此選擇pH 3.3的0.1%乙酸水溶液作為流動相。

圖2 不同流動相下8種真菌毒素的色譜峰響應Fig.2 Chromatographic response of 8 types of mycotoxin in vary of mobile phases

2.3 質譜條件的優化

通過單個分析物標準品溶液上機分析，得到目標分析物的質荷比。為了進一步對化合物進行確證分析，在碰撞誘導解析電離模式(CID)下，通過分析單個目標物標準品溶液，優化了去簇電壓和碰撞電壓，得到離子豐度較大的碎片離子為該化合物裂解的主要碎片離子。表1為ESI模式下，各化合物的主要碎片離子的質荷比。圖3為MRM模式下真菌毒素標準溶液的選擇離子流圖。

圖3 優化條件下8種真菌毒素標準溶液的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of eight mycotoxin in optimum conditions

2.4 樣品基質效應的消除

該實驗中采用的同位素內標黃曲霉毒素B113C17、黃曲霉毒素B213C17、黃曲霉毒素G113C17、黃曲霉毒素G213C17、伏馬毒素B113C34、伏馬毒素B213C34、柄曲霉素13C18和異煙棒曲霉素13C22，各化合物的碳均為13C的穩定同位素內標，它們在定性、定量離子通道中相互無干擾，并且該內標物是人工合成，不存在于自然界中，為較好的內標物。但同位素內標難以得到，費用極高。實驗對比了上述8種同位素內標和1種同位素內標(黃曲霉毒素B113C17)消除基質干擾的回收率，加標水平為各化合物的兩倍定量下限(內標混合液最大濃度為20 μg/L)，結果見表2。由表2可見，實驗分析的8種化合物極性差別較大，性質各不相同，用同1種內標來消除干擾的分析結果并不理想。因此，最終將8種同位素內標都作為本實驗的同位素內標物，用來同時對8種真菌毒素進行準確定量。

表2 8種同位素內標和單一同位素內標(黃曲霉毒素B113C17)的加標回收率對比Table 2 Comparison of recoveries between eight kinds of isotope internal standards and single isotope internal standard(AFB113C17) /%

2.5 線性方程與定量下限

配制質量濃度為0.1～200 μg/L的系列混合標準工作溶液，以目標組分和內標的峰面積比值為縱坐標(Y)，對應的質量濃度比值為橫坐標(X)，繪制標準曲線。8種真菌毒素在以上質量濃度范圍內具有良好的線性關系，線性相關系數均不低于0.997 0。以信噪比為10計算方法的定量下限(LOQ)，結果見表3。

表3 8種化合物的線性范圍、線性方程、相關系數以及定量下限Table 3 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients(r)and limits of quantitation(LOQs)of eight target compounds

2.6 回收率與精密度

以各化合物的1倍、2倍定量下限(內標混合液最大濃度為20 μg/L)為3種空白樣品的加標水平，在優化條件下，每個樣品平行分析6次，計算回收率和精密度。各化合物的回收率為77%～123%，相對標準偏差為0.6%～13.3%(結果見表4)。

表4 8種化合物的加標回收率與相對標準偏差(n=6)Table 4 Recoveries and RSDs of eight target compounds(n=6) /%

2.7 實際樣品的篩查

按照本方法對超市及農貿市場購買的大米、小麥和黃豆樣品進行測定，每種樣品各3批，結果在小麥粉中檢出陽性樣品，分別含有柄曲霉素0.73、0.33、0.49 μg/kg，但均未超過歐盟等發達國家的限量要求。

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