硅溶膠－納米金修飾金電極電化學發光法測定苦參堿的研究

羅 應，李利軍，鄧春燕，程 昊，孫 科，李彥青

(廣西工學院 生物與化學工程系，廣西 柳州 545006)

苦參堿(Matrine，MT，結構式見圖1)是從豆科槐屬植物苦豆子(Sophora alopecuroides L)的干燥根、植株、果實中提取的一種具有廣泛生物活性的生物堿，具有鎮咳、護肝、保肝、鎮痛、消炎抗菌、清熱利尿、抗腫瘤、抗過敏、抗心率失常等多種藥理作用［1］。目前，關于苦參堿的測定方法有高效液相色譜法［2－3］、毛細管電泳法［4－5］、直接電化學法［6］、氣相色譜法［7］、液相色譜質譜聯用法［8］等。但這些方法或操作繁瑣，或涉及有毒試劑，或使用的儀器設備貴重以及需專業的技術人員。與之相比，電化學發光法的選擇性好、靈敏度高、操作簡單。因此，研究和建立簡單、快速、靈敏的苦參堿電化學發光分析新方法具有重要的理論意義和潛在的應用價值。

圖1 苦參堿的分子結構Fig.1 Molecular structure of matrine

傳統的電化學發光(ECL)研究僅限于在裸電極/電解液界面上，而電極表面的分子剪裁、微結構的設計及其潛在應用價值的研究，提高了電化學發光的靈敏度，將其應用推進到一個新的階段。化學修飾電極在提高選擇性和靈敏度方面具有獨特的優越性，修飾電極表面上的微結構可提供多種能利用的勢場，使待測物能夠進行有效的分離富集，基于控制電極點位還可進一步提高其選擇性［9］。目前，有關修飾電極的研究已有報道。郭志慧等［10］用Nafion膜修飾電極，周谷珍等［11］用Self-Assembling(SA)膜法修飾電極，Bard等［12］用Langmuir－Blodget(LB)膜法修飾電極。但這些方法都存在不足之處，如Nafion膜的傳質過程較慢［13］，自組裝膜在反復的電壓掃描時不穩定;LB膜易被有機溶劑破壞而剝離電極等。本文采用溶膠－凝膠法對電極進行了修飾。

硅溶膠是二氧化硅膠體微粒在水中均勻擴散形成的乳白色半透明膠體溶液，可形成三維網絡結構，具有較好的生物相容性、物理剛性、化學惰性、熱穩定性及在水中幾乎不溶脹等性質［14］。硅溶膠具有成膜溶解的特性，但在成膜時收縮較大、易龜裂，為克服這個缺點，可添加水溶性乳液作為輔助成膜物，如聚乙烯醇(PVA)。納米金具有高比表面積、高表面活性及良好的導電性等特性［15］，因其可提高電極與表面修飾物之間的電子傳遞，增加電極表面的反應位點，而被廣泛應用于修飾電極。但將硅溶膠與納米金制成混合液修飾金電極用于聯吡啶釕體系中的報道較少。本文將硅溶膠、聚乙烯醇(PVA)、L-半胱氨酸按比例混合制成復合物溶液，再將納米金與復合物溶液超聲混合后作為電極修飾材料，實驗結果表明此修飾電極對聯吡啶釕具有很好的電化學和電化學發光特性。據此建立了電化學發光測定苦參堿的新方法，并將其成功應用于藥片中苦參堿含量的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MPI-E型電致化學發光分析系統(西安瑞邁電子科技有限公司);DL－60D型超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司);XW－80A型旋渦混合器(上海精科實業有限公司);EF20 pH計(梅特勒－托利多儀器上海有限公司)。電化學實驗采用三電極系統:硅溶膠－納米金修飾的金電極作為工作電極，Pt絲電極為對電極，Ag/AgCl(飽和KCl溶液)為參比電極。

1.5×10－4mol/L苦參堿標準儲備液:準確稱取0.003 7g苦參堿(中國藥品生物制品檢定所)，用水定容于100 mL的棕色容量瓶中，超聲脫氣后冷藏于冰箱中(4℃)備用;1.0×10－3mol/L聯吡啶釕儲備液:準確稱取六水合三(2，2-聯吡啶)氯化釕(購于Aldrich公司)0.018 7 g，用水定容于25 mL的棕色容量瓶中，用超聲波除氣后放入冰箱中(4℃)冷藏;氯金酸(上海科興實驗室設備有限公司);檸檬酸三鈉(臺山市粵僑試劑塑料有限公司);PVA4000(廣州化學試劑廠);L-半胱氨酸(上海晶純試劑有限公司);硅溶膠、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼酸、四硼酸鈉(西隴化工股份有限公司)，所用試劑除苦參堿、聯吡啶釕為優級純外，其它均為分析純。實驗用水均為二次石英亞沸水。

1.2 修飾電極的制備

1.2.1 金電極的預處理 修飾前用金相砂紙小心打磨金絲電極(d=1 mm)，并在鹿皮上用Al2O3粉(d50=20～50 nm)拋光至鏡面，用水沖洗后，依次用水、無水乙醇－水(1∶1，體積比)、水超聲清洗，晾干。將其置于0.10 mol/L H2SO4溶液中進行循環伏安掃描，直至得到穩定的循環伏安(CV)曲線，晾干待用。

1.2.2 納米金的制備 納米金的制備方法與文獻［16］相似。將氯金酸溶液置于數顯測速恒溫磁力攪拌器上，在600 r/min轉速下攪拌加熱至沸騰，再加入一定量的檸檬酸三鈉，使液體顏色穩定并持續加熱一段時間后，停止加熱，冷卻至室溫，得納米金溶膠。

1.2.3 硅溶膠－納米金混合溶液的制備 將0.3 mL硅溶膠、0.15 mL L-半胱氨酸(10 mmol/L)、0.2 mL 0.05%的PVA混合，制成硅溶膠混合溶液，再向其中加入0.2 mL納米金制成硅溶膠－納米金混合溶液。

1.2.4 硅溶膠修飾金電極與硅溶膠－納米金修飾金電極的制備 將經過預處理的金電極浸入0.65 mL硅溶膠混合液中，約30 s后取出，在4℃下放置12 h后得硅溶膠修飾金電極;將經過預處理的金電極浸入0.85 mL硅溶膠－納米金混合液中，約30 s后取出，在4℃下放置12 h后得到硅溶膠－納米金修飾金電極。

1.3 實驗方法

實驗在室溫下進行，測定發光強度前溶液用超聲波除氣5 min，所有電位值均相對于參比電極。由MPI-E型電致化學發光工作站分別記錄Ru(bpy發光強度I0和Ru(bpy與苦參堿的發光強度I，以相對強度(I－I0)繪制相對峰高強度與苦參堿濃度的校正曲線。工作電極采用硅溶膠－納米金修飾的金電極，支持電解質為0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 9.0)，光電倍增管負高壓為800 V，循環伏安掃描速率為100 mV/s。電化學發光檢測池如圖2所示。

圖2 電化學發光檢測示意圖Fig.2 Schematic diagram of the ECL detection cell

2 結果與討論

2.1 苦參堿在不同電極上的電化學與電化學發光行為

考察了苦參堿在不同電極上的電化學和電化學發光行為。圖3A為苦參堿在硅溶膠－納米金修飾的金電極(a)、硅溶膠修飾的金電極(b)和裸金電極(c)上的CV圖。由圖3A可以看出，在相同條件下，硅溶膠－納米金修飾金電極比硅溶膠修飾金電極對聯吡啶釕的增敏效果好，氧化峰電流由8.1 μA增至16.2 μA，增大了2倍。同時，修飾電極與裸電極相比，充電電流明顯增大，這是因為硅溶膠、納米金的加入增加了電極的比表面積和電極表面的反應位點。因此，最終采用硅溶膠－納米金修飾的金電極作為工作電極。

由圖3B可以觀察到苦參堿在硅溶膠－納米金修飾的金電極(a)、硅溶膠修飾的金電極(b)和裸金電極(c)上的發光強度分別為1 549、896和230，硅溶膠－納米金修飾的金電極上的發光強度大大增加，是裸電極的6.7倍。這表明硅溶膠、納米金的加入增加了電極的比表面積和電極表面的反應位點，與圖3A的結論一致。

圖3 苦參堿在不同電極上的循環伏安圖(A)和循環伏安發光圖(B)Fig.3 CVs(A)and ECL curves(B)of different electrodes in 1.50×10－5mol/L matrine

2.2 苦參堿對Ru(bpy)電化學與電化學發光行為的增敏作用

實驗于0.2～1.25 V的電位范圍，考察了Ru(bpy苦參堿與Ru(bpy共存體系在硅溶膠－納米金修飾金電極上的電化學行為和電化學發光行為(見圖4)。從圖4A的循環伏安圖可以觀察到Ru(bpy在0.95～1.15 V左右出現一氧化峰(曲線a)，當加入苦參堿后，氧化峰電流升高，峰電位仍在0.95～1.15 V左右(曲線b)，該現象表明苦參堿對Ru(bp的電化學反應有明顯的增敏作用。同時可以觀察到共存體系中僅在1.1 V左右出現1個特征氧化峰，說明苦參堿和Ru(bpy發生電化學共反應前并未被氧化，1.1 V處的電流為Ru(bp氧化所致。

從圖4B的電化學發光圖觀察到，當加入一定濃度的苦參堿時，Ru(bpyECL強度從380(曲線a)增加到12 582(曲線b)，在1.0 V開始出現發光信號，到1.1V達到最大值，這與圖4A中在1.1 V處氧化峰電流達到最大相符。可見，在相同的條件下，加入苦參堿后，Ru(bpy的發光強度增加約25倍，說明苦參堿對Ru(bp的ECL強度具有顯著增強作用。

圖4 苦參堿對Ru(bpy循環伏安圖(A)及電化學發光圖(B)的增敏作用Fig.4 CVs(A)and ECL curves(B)of matrine on silica sol－nano-gold modified gold

2.3 緩沖體系以及pH值的選擇

緩沖體系及pH值對生物堿類藥物與Ru(bpy)2+3的反應有重要影響。本實驗考察了0.2 mol/L H3BO3－0.05 mol/L Na2B4O7·10H2O緩沖體系和0.1 mol/L Na2HPO4－0.1 mol/L NaH2PO4緩沖體系對聯吡啶釕－苦參堿體系ECL強度和穩定性的影響(見圖5)。結果表明，PBS緩沖體系的電化學發光強度明顯優于硼酸體系，在酸性環境或堿性過高的情況下ECL強度較低，在pH 9.0時達到最大值，可能是由于溶液中過多的OH－參與電極上的競爭反應造成高價態聯吡啶釕(Ⅲ)減少。綜合考慮，實驗選擇pH 9.0的PBS緩沖體系作為最佳介質。

圖5 緩沖溶液pH值對電化學發光強度的影響Fig.5 Effect of pH value on ECL intensity

2.4 修飾劑配比的選擇

納米金的濃度不但影響聯吡啶釕的ECL強度，而且也影響膜的電子傳遞及機械強度。實驗結果顯示，在硅溶膠中不斷增加納米金量的過程中，電極表面的催化活性位點不斷增加，其氧化電流增大，ECL強度也隨之增強;但當納米金與硅溶膠的體積比超過1∶3時，過多的納米金易發生團聚而使電極重復性變差，信噪比降低。因此實驗選擇納米金與硅溶膠的體積比1∶3作為修飾劑的最佳配比。

2.5 儀器參數的優化選擇

光電倍增管負高壓影響儀器檢測的靈敏度及穩定性，考察了不同負高壓對電化學發光強度的影響，結果表明:隨著負高壓的增大，發光強度和噪聲均增大，為了得到足夠的靈敏度和較低的噪音，選擇800 V作為本實驗的負高壓。考察了不同掃描速率(10～100 mV/s)對ECL發光強度的影響，結果表明:隨著掃描速率的增大發光強度增大，當達到100 mV/s后基本趨于平衡，這可能是由于較大的掃描速率可以保證在電極表面產生足夠的高價聯吡啶釕(Ⅲ)，同時有限的電極表面積使產生的高價聯吡啶釕(Ⅲ)的量達到一定的平衡，因此發光強度值基本不變，但過高的掃描速率會影響儀器的使用壽命。綜合考慮，選擇100 mV/s作為本實驗的最佳掃描速率。

圖6 不同濃度苦參堿的電致化學發光曲線Fig.6 ECL curves of different concentrations of matrine cmatrine(a－ f):0.15，3.0，12.0，30.0，90.0，150.0 μmol/L;insert:calibration curve of ECL intensity vs.matrine concentration

2.6 方法的評價

在最佳實驗條件下，通過電致化學發光工作站記錄了不同濃度苦參堿標準溶液的發光強度響應曲線(圖6A)，以相對峰高對其濃度進行線性回歸。苦參堿濃度在1.5×10－7～1.5×10－4mol/L 范圍內呈線性關系(r2=0.998 4)(圖6B)，其線性回歸方程為:I=81.023×106c+228.26，檢出限(S/N=3)為7.3×10－9mol/L，連續 8次測定 1.5×10－5mol/L的苦參堿，發光強度值的RSD為1.4%。

2.7 樣品的分析

取1枚苦參堿栓50 mg(武漢人福藥業有限責任公司)，溶于5 mL 0.1 mol/L鹽酸，過濾后用水定容至200 mL棕色容量瓶中，稀釋后其標示濃度為1.00×10－5mol/L，在最佳實驗條件下對該樣品平行測定5次，其RSD為2.4%，表明此方法的重現性好。

在樣品中加入標準溶液進行回收率實驗，測得回收率為98%～102%，平均回收率為100%，RSD為1.8%，表明方法具有較好的靈敏度和重現性，可有效用于實際樣品的分析。

3 結論

建立了以硅溶膠－納米金修飾的金電極作為工作電極電化學發光測定苦參堿的方法，充分利用硅溶膠、納米金的高靈敏電催化作用，提高了電極的電流響應，拓展了線性范圍。該修飾電極結合了硅溶膠和納米金的優點，具有靈敏度高、穩定性好和操作簡便等特點，拓寬了聯吡啶釕電化學發光體系的應用范圍，若將此方法應用于傳感器的制備將具有重要意義。

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