高效液相色譜－串聯質譜法同時測定飼料中氯霉素、甲砜霉素與氟甲砜霉素殘留量

馮 民，魏云計*，朱臻怡，何 健，王小晉，柳 菡，丁 濤，吳 斌

(1.淮安出入境檢驗檢疫局，江蘇 淮安 223001;2.江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，江蘇 南京 210001)

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素屬于氯霉素類抗生素，因對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有很強的活性，而表現出廣譜的抗菌能力，廣泛地應用于動物養殖業。由于這些氯霉素類抗生素能導致人體產生再生障礙性貧血和溶血性貧血等毒副作用［1］，歐盟、美國等先后將其定為禁用藥物，不得用于畜牧養殖業中，且動物源性食品中氯霉素的最高殘留限量為0.1～0.3 μg/kg，甲砜霉素和氟甲砜霉素的最高殘留限量一般為50～100 μg/kg。雖然它們在動物體內殘留量低，但毒副作用依然存在。飼料一般是獸藥添加的主要載體，開展飼料中氯霉素類藥物檢測是從源頭進行控制的有效方法，因此研究飼料中氯霉素類藥物檢測的方法具有重要意義。

目前國內外關于氯霉素類藥物的殘留檢測方法已很成熟，主要采用酶聯免疫法［2－4］、高效液相色譜法［5－7］、氣相色譜 －質譜法［8－10］和液相色譜 －串聯質譜法［11－16］。由于飼料的組成成分復雜、基質干擾較大，針對其氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留量同時檢測的液相色譜－串聯質譜法國內尚未見報道。本文利用液相色譜－串聯質譜的高選擇性和強抗干擾能力等特點，建立了飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留的快速定性定量方法，能滿足飼料進出口檢測和國家藥物殘留監控的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Finngan TSQ Quantum Ultra EMR串聯質譜儀，配有電噴霧離子源(ESI);C18柱(150 mm×2.1 mm i.d.，3.5 μm，Agilent公司)。

甲醇為色譜純;乙酸乙酯、正己烷、丙酮、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉均為分析純;氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素標準品均購自Dr.Ehrenstorfer GmbH，純度≥98%;氘代氯霉素(Chloramphenicol-D5)購自WITEGA Laboratorien Beelin－Adlershof GmbH，用甲醇溶解并配制成1.0 g/L標準儲備液，再根據需要稀釋成適當濃度的混合標準工作液，4℃避光保存;實驗用水均為去離子水。

1.2 樣品前處理

1.2.1 樣品提取 稱取(1.00±0.05)g飼料于50 mL具塞離心管中，準確加入50 μL 100 μg/L氯霉素-D5內標溶液，加入4 mL 0.5 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液，于渦旋混合器上混勻30 s后靜置15 min待飼料浸潤，加入10 mL氨化乙酸乙酯(乙酸乙酯－25%氨水，98∶2)，于渦旋混合器上快速混勻30 s，超聲波提取10 min;以8 000 r/min離心5 min，轉移上層有機溶液至50 mL梨形瓶中，于45℃水浴中減壓濃縮至干，加入4 mL 4%氯化鈉溶液使之充分溶解，待凈化。

1.2.2 凈 化 上述溶液用5 mL正己烷凈化脫脂，離心后棄去正己烷層;水層加入8 mL丙酮，離心后轉移上清液于50 mL具塞離心管中，加入10 mL二氯甲烷，渦旋30 s;以8 000 r/min離心5 min，轉移下層有機溶液至50 mL梨形瓶中，于45℃水浴中減壓濃縮至干，用1 mL甲醇－水(2∶8)溶解殘留物，經0.45 μm濾膜過濾，濾液供液相色譜－串聯質譜儀測定。

1.3 液質聯用儀分析條件

色譜條件:色譜柱:Agilent ZORBAX SB－C18柱(150 mm×2.1 mm i.d.，3.5 μm);流動相:A為甲醇，B為水;流速:250 μL/min;進樣量:25 μL;線性梯度洗脫程序:0～4.0 min，30%A;4.0～6.0 min，30%～90%A;6.0～6.5 min，90%～30%A;6.5～8.0 min，30%A;柱溫:30℃。

質譜條件:采用電噴霧離子源(ESI)，負離子掃描，噴霧電壓2 500 V，源內誘導解離電壓10 V，多反應監測(MRM)方式檢測，其他質譜條件見表1。

表1 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素優化的質譜條件Table 1 The optimized MS－MS conditions for chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

為降低高濃度氯霉素類藥物殘留對儀器的干擾，提高檢測靈敏度，采用流動相注射分析方法進行質譜條件的優化。流動相為甲醇－水(80∶20)，流速200 μL/min，蠕動泵注入1.0 mg/L混合標準溶液，流速為2 μL/min，通過“T”三通連接，六通閥控制流動相切入/切出質譜檢測器;負離子模式下進行母離子全掃描，找出準確母離子峰，通過調節噴霧電壓和吹掃氣流優化母離子的靈敏度和穩定性，并對其子離子進行全掃描，找出豐度較強的碎片離子，以母離子和子離子組成監測離子對，以MRM模式對待測物進行定性和定量分析。選擇豐度最強，并且色譜峰無干擾的碎片離子組成監測離子對，m/z 321/152、m/z 354/185和m/z 356/336分別用于氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的定量分析，其它離子對則分別用于定性分析;內標氘代氯霉素定性離子對為m/z 326/157。

圖1 不同提取溶劑時氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的回收率Fig.1 Recoveries of chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol using different extraction solvents

2.2 提取條件的優化

氯霉素類藥物屬于弱極性物質，易溶于甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑，可以通過這些溶劑進行提取。乙酸乙酯對氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的提取效率最高，適合于動物組織樣品的提取，有文獻［17］報道堿化乙酸乙酯對蝦等水產品有更好的回收率。由于飼料含有大量的脂肪、蛋白質、纖維素、礦物質等復合組分，本研究比較了乙腈、丙酮、乙酸乙酯以及分別經1%、2%、3%、4%氨水堿化乙酸乙酯的提取效率(見圖1)。實驗結果表明，當采用2%氨水堿化乙酸乙酯進行提取時，3種藥物的提取效率及穩定性最好，隨著氨水比例的進一步提高，其提取效率無明顯提高且對提取甲砜霉素的干擾增大，因此選用2%堿化乙酸乙酯為最佳提取溶劑。飼料樣品的水分很少，在提取前充分潤濕有利于目標物的提取，本實驗采用磷酸鹽緩沖液潤濕飼料，可達到沉淀蛋白質，減少氯霉素類藥物與蛋白質結合，提高回收率的效果。

2.3 樣品的凈化

堿化乙酸乙酯的提取效率雖高，但提取的非極性脂溶物較多，基質干擾較大，需要進一步凈化。文獻［17］以甲醇和4%氯化鈉溶液溶解目標物，正己烷凈化脫脂兩次，乙酸乙酯進行液－液分配萃取凈化，取乙酸乙酯層濃縮至干，用0.05%醋酸溶液溶解后再過C18固相萃取柱凈化。本研究結合液相色譜－串聯質譜強選擇性和抗干擾能力的特點，用4 mL 4%氯化鈉溶液溶解目標物，5 mL正己烷凈化脫脂，除去正己烷層，加入8 mL丙酮離心，除去變性蛋白質后，再加入10 mL二氯甲烷進行液－液分配萃取凈化。通過對比文獻［17］發現本方法可有效去除基質干擾，省去固相萃取過程，縮短樣品前處理時間，空白樣品的加標回收率為77%～108%，可滿足實驗要求。

2.4 線性范圍、檢出限與定量下限

配制6個不同質量濃度的標準溶液，溶液中氯霉素、氟甲砜霉素的質量濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L，甲砜霉素的質量濃度為1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/L，氘代氯霉素-D5的質量濃度為5.0 μg/L，在優化實驗條件下進樣分析，測定其峰面積，以質量濃度為橫坐標，峰面積比值(氯霉素峰或甲砜霉素或氟甲砜霉素的面積/氘代氯霉素-D5面積)為縱坐標，繪制標準曲線，各化合物的回歸方程、相關系數如表2所示。在空白飼料基質中添加混合標準品，以信噪比(S/N)≥3計算方法的檢出限(LOD);以信噪比(S/N)≥10計算方法的定量下限(LOQ)，3種化合物的檢出限和定量下限見表2。其相應的MRM色譜圖見圖2A，標準溶液的MRM色譜圖見圖2B。

表2 3種抗生素藥物的回歸方程、相關系數(r2)、檢出限和定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients(r2)，limits of detection(LOD)and limits of quantitation(LOQ)of three antibiotic drugs

圖2 加標飼料(A)及3種抗生素藥物標準溶液(B)的MRM色譜圖Fig.2 Multiple reaction monitoring(MRM)chromatograms of spiked feed sample(A)and three antibiotic drugs standard solution(B)

2.5 回收率與精密度

選取陰性飼料樣品，添加3種氯霉素類標準品和內標，氯霉素、氟甲砜霉素的加標水平為0.3、1.0、5.0 μg/kg，甲砜霉素的加標水平為 1.5、5.0、25.0 μg/kg，氘代氯霉素-D5的加標水平為5.0 μg/kg，每個加標水平做5次平行，結果見表3。結果顯示，待測物的加標回收率為77%～108%，相對標準偏差為5.4%～10.9%。

表3 飼料樣品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的回收率與相對標準偏差(n=5)Table 3 Recoveries and RSDs of chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol in feed sample(n=5)

2.6 實際樣品的檢測

應用本方法對出口的寵物飼料及市場抽取的水產飼料和畜禽飼料共19個樣品進行檢測，其中8個樣品中的氯霉素殘留量大于0.3 μg/kg，陽性率為42.1%;4個樣品中的氟甲砜霉素殘留量大于0.3 μg/kg，陽性率為21.1%;2個樣品中的甲砜霉素殘留量大于1.5 μg/kg，陽性率為10.5%，但上述樣品的藥物殘留量均小于國家殘留監控的限量要求。

3 結論

本文建立了飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留同時測定的高效液相色譜－串聯質譜分析方法。該法采用串聯質譜和同位素內標消除了飼料復雜基質的影響，提高了定量的準確性。該方法操作簡便，省去了固相萃取步驟，縮短了檢測周期，方法的靈敏度高，回收率好，可滿足實際檢測工作的需要。

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