大蒜素對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠肺組織水通道蛋白-1表達(dá)的影響*

陳華文 馮 俊△ 易旻曉 祝 偉 李樹生

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，湖北 武漢 430030；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院，湖北 武漢 430030）

急性肺損傷（ALI）是以通透性肺水腫為特征的一種臨床綜合征，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究表明水通道蛋白-1（AQP-1）與肺水腫有關(guān)，AQP-1對于維持血管與間質(zhì)之間水運(yùn)動(dòng)的平衡有重大意義［1］。大蒜素為植物大蒜中的重要活性成分，其對多種微生物具有強(qiáng)大的抑制和殺滅作用，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)大蒜素對脂多糖（LPS）致膿毒癥急性肺損傷具有保護(hù)作用［2］。本研究主要觀察脂多糖致大鼠ALI時(shí)AQP-1表達(dá)的變化情況，并給予大蒜素干預(yù)，探討大蒜素對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷的具體機(jī)制，以期為治療膿毒癥提供更充分的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 內(nèi)毒素（EscHErichiacoh055：B5，L2880美國 Sigma公司），抗 AQP-1 抗體（chemicon 公司）；SP試劑盒和DA B顯色試劑盒、大蒜素（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）；Trizol提取液（15596-026美國Gibco-BRL公司），RT-PCR試劑盒 （大連寶生物公司），PCR引物（上海生物工程有限公司合成）。

1.2 動(dòng)物與分組 成年SPF級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量220～250 g，8～10周齡，由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為LPS組、大蒜素組和對照組，每組10只。

1.3 造模及給藥 通過鼠尾靜脈注射LPS復(fù)制內(nèi)毒素大鼠模型。LPS組和大蒜素組給予LPS 5 mg/kg，用生理鹽水稀釋至2 mL靜脈注射，對照組給予生理鹽水2 mL靜脈注射。造模成功后，大蒜素組立即給予大蒜素20 mg/kg，用生理鹽水稀釋至2 mL靜脈注射，LPS組和對照組給予生理鹽水2 mL靜脈注射。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 分別在用藥后6 h時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)快速處死大鼠，取右肺葉作病理切片備用；另取右中肺組織放入裝有RNA保護(hù)液的凍存管內(nèi)迅速置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩＃?）病理學(xué)檢測：取大鼠肺組織，10%中性甲醛固定，脫水后常規(guī)石蠟包埋，切片厚度4 μm，蘇木精-伊紅染色，普通光學(xué)顯微鏡400倍下觀察肺組織病理學(xué)變化。（2）免疫組化法檢測肺組織AQP蛋白分布：采用SP法，切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化后，用3% 過氧化氫去除內(nèi)源性氧化酶，微波抗原修復(fù)，余步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。用已知陽性片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。AQP-1抗體稀釋濃度為1∶400。細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色著染者為陽性表達(dá)細(xì)胞。（3）實(shí)時(shí)定量PCR檢測肺組織AQPsmRNA表達(dá)：取右肺中葉組織，采用TRIzol試劑參照說明書提取總RNA，取2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，其中2 μL cDNA為模板擴(kuò)增，肌動(dòng)蛋白β-actin為內(nèi)參照，并設(shè)陰性對照。反應(yīng)條件相同。AQP-1 引物序列：Forward primer（5′-3′）5′-CTGGCCTTTGGTTTGAGCAT-3′；Reverse primer（5′-3′）5′-CCACACACTGGGCGATGAT′；β-actin 引物序列：Forward primer （5′-3′）5′-ACGGCCAGGTCATCACTATTG-3′；Reverse primer （5′-3′）5′-TGGATGCCACAGGATTCCAT-3′。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析及q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織病理學(xué)結(jié)果 鏡下所示對照組肺組織結(jié)構(gòu)正常。LPS組可見肺組織彌漫性中性粒細(xì)胞浸潤，肺泡腔變窄，肺泡壁增厚，肺間質(zhì)充血水腫明顯，部分肺泡融合。大蒜素組中性粒細(xì)胞浸潤有所減輕，肺間質(zhì)水腫減輕。

2.2 各組大鼠肺組織AQP-1蛋白表達(dá) 對照組正常肺組織表達(dá)高水平AQP-1蛋白，染色呈棕黃色顆粒，可見在氣道周圍毛細(xì)血管和肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上呈明顯棕黃色分布。LPS組肺組織AQP-1蛋白表達(dá)顯著下降，大蒜素組肺組織AQP-1蛋白表達(dá)較LPS組升高，但仍低于正常水平。見表1。

表1 各組肺組織AQP-1免疫組化染色結(jié)果比較（）

表1 各組肺組織AQP-1免疫組化染色結(jié)果比較（）

與對照組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，△P＜0.05。下同。

2.3 各組大鼠肺組織AQP-1 mRNA的表達(dá) 見表2。與對照組比較，LPS組肺組織AQP-1mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05），大蒜素干預(yù)后，肺組織AQP-1蛋白表達(dá)較LPS組升高，但仍低于正常水平（P<0.05）。

表2 各組肺組織中AQP-1 mRNA表達(dá)比較（）

表2 各組肺組織中AQP-1 mRNA表達(dá)比較（）

3 討 論

ALI發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，肺泡內(nèi)液體清除障礙是重要發(fā)生機(jī)制之一。在肺組織肺泡內(nèi)水的轉(zhuǎn)運(yùn)主要有兩條途徑，一是伴鈉的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，二是經(jīng)肺泡上皮的水通道蛋白（AQPs）。研究表明，AQPs與肺水腫有關(guān)，是一組與水通透性有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它的發(fā)現(xiàn)在分子水平揭示了水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)的基本機(jī)制，分布于肺組織中的AQPs有6種，AQPs組織分布的顯著特點(diǎn)為同一細(xì)胞定位上沒有兩種以上AQPs重疊分布［2］。AQP-1主要在氣道周圍毛細(xì)血管、淋巴管及肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和臟層胸膜間皮細(xì)胞上表達(dá)，主要負(fù)責(zé)清除支氣管和脈管周圍組織的內(nèi)水分［3］，各種肺損傷常伴有肺水腫的發(fā)生，而肺水腫以肺泡和間質(zhì)內(nèi)液體積聚為特點(diǎn)，發(fā)生時(shí)必然伴有水轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂及AQPs質(zhì)或量的改變。研究發(fā)現(xiàn)AQP-1表達(dá)下降會(huì)導(dǎo)致跨細(xì)胞水轉(zhuǎn)運(yùn)的速率降低，從而影響水腫液吸收，加重肺泡和間質(zhì)水腫，從而加重其肺組織的病理性改變［4-5］。已有研究證實(shí)，在靜脈注射LPS致ALI模型中，以LPS 4 mg/kg劑量可以達(dá)到理想效果，并且4～12 h出現(xiàn)明顯肺水腫，檢測肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮AQP-1蛋白表達(dá)數(shù)量明顯減少［6］，本實(shí)驗(yàn)觀察到觀察到注射LPS后可迅速下調(diào)肺組織AQP1基因的表達(dá)，與雷賢英等［7］實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

大蒜素化學(xué)名稱為二烯丙基三硫，有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化及清除氧自由基的作用［8-9］，對LPS導(dǎo)致的小鼠ALI具有防治作用，其機(jī)理與其能降低炎癥因子水平有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用大蒜素的治療組較LPS組肺組織AQP-1的蛋白和mRNA的表達(dá)均明顯升高，同時(shí)HE染色病理學(xué)檢查表明肺組織損傷明顯減輕，表明大蒜素對內(nèi)毒素血癥時(shí)肺尤其是內(nèi)毒素血癥早期具有保護(hù)效應(yīng)，且其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)肺組織AQP-1的表達(dá)有關(guān)，AQP-1在調(diào)節(jié)肺內(nèi)液體平衡中起到明顯作用，可能參與了ALI肺水腫的發(fā)病機(jī)制，大蒜素可能通過干預(yù)AQP-1的表達(dá)改善膿毒癥肺損傷的病理變化。

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