益氣活血方對大鼠肺組織基因表達譜的影響*

劉 欣 王炳勝 劉秀芳 張 海 李鳳玉 張建宇 葛艷麗 李衛威

（1.河北北方學院，河北 張家口 075000；2.解放軍第二五一醫院，河北 張家口 075000）

數字化基因表達譜（Digital Gene Expression Profile）是利用新一代高通量測序和高性能的計算機分析技術，全面、經濟、快速地檢測某一特定組織在特定狀態下的基因表達情況，這一技術已被廣泛應用于疾病發病機制、藥物研發等研究領域。研究表明，益氣活血方能夠降低放射性損傷相關細胞因子的表達，降低其發生率，減輕其癥狀持續時間［1-4］，是腫瘤放化療患者良好的輔助用藥，但其作用的分子機制不明確。本實驗采用數字化基因表達譜分析益氣活血方對大鼠肺組織基因表達的影響，從而了解益氣活血方作用的分子機制，為該藥在臨床上推廣應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物 20只健康雌性成年Wistar大鼠20只，體質量（200±20） g，許可證號 scxk（京 2012-0001），合格證號026150，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。在SPF級實驗室飼養3 d，無異常者入組者實驗。

1.2 試劑及儀器 主要試劑為Illumina Gene Expression Sample Prep Kit和Illumina測序芯片（flow-cell）；主要儀器為Illumina Cluster Station和Illumina HiSeq 2000系統。

1.3 藥物 益氣活血方，組方：黃芪30 g，黨參25 g，白術 15 g，茯苓 15 g，丹參 30 g，雞血藤 30 g，地龍 15 g，川芎 15 g，當歸 20 g，苦參 30 g，香附 30 g，麥冬 15 g，枇杷葉15 g，紫金牛10 g。藥材水煎、醇沉、濃縮、分裝、消毒備用，生藥含量2 g／mL。

1.4 分組與造模 將大鼠隨機分為益氣活血方組10只（中藥組）、空白對照組10只（對照組）。中藥組大鼠每日灌胃益氣活血方1 mL，對照組每日灌胃蒸餾水1 mL，直至動物被處死取材。

1.5 標本采集 兩組大鼠分別于首次灌胃起第6、12周末，各隨機抽取5只，用戊巴比妥鈉0.04 g/kg腹腔麻醉后立即開胸取其右肺組織，并保存于-80℃冰箱備用。

1.6 數字化基因表達譜信息分析流程

1.6.1 Tag的制備 提取 6 μL總 mRNA，利用Oligo（dT）磁珠吸附純化 mRNA，并以 Oligo（dT）引導反轉錄合成雙鏈cDNA。采用四堿基識別酶NlaⅢ，識別并切斷cDNA上的CATG位點，利用磁珠沉淀純化帶有cDNA 3'端的片段，將其5'末端連接Illumina接頭1。利用MmeI酶切CATG位點下游17 bp處，通過磁珠沉淀去除3'片段后，在Tag3'末端連接Illumina接頭2，從而獲得兩端連有不同接頭序列的21 bp標簽library。經過15個循環的PCR線性擴增后，通過6%TBEPAGE膠電泳純化95堿基條帶，解鏈后，單鏈分子被加到Illumina測序芯片（flowcell）上并固定，每條分子經過原位擴增成為一個單分子簇 （cluster）測序模板，加入4色熒光標記的4種核苷酸，采用邊合成邊測序法（SBS）測序。測序得到的原始圖像數據經basecalling轉化為序列數據，稱為原始Tag。

1.6.2 Clean Tag 原始序列帶有一段3'adaptor序列，并且含有少量低質量序列以及各種雜質成分。經過一系列數據處理，得到Clean Tag。

1.6.3 基因表達注釋 經過測序質量評估、測序飽和度分析、實驗重復性分析、Cleantag拷貝數分布統計、Clean Tag比對統計等一系列處理后對基因表達進行注釋。

1.6.4 差異基因的篩選 參照文獻［5］的數字化基因表達譜差異基因檢測方法，開發了嚴格的算法篩選兩樣本間的差異表達基因。在本次分析中，差異表達基因定義為FDR≤0.001且倍數差異在2倍以上的基因。通過對Gene Ontology功能顯著性富集分析、Pathway顯著性富集分析、差異基因表達模式聚類分析等一系列后續處理后得出結果。通過GO功能顯著性富集分析能確定差異表達基因行使的主要生學功能。

2 結 果

中藥組對比對照組在6周末差異表達基因為1338個，其中上調基因為705個，下調基因為633個。以corrected-pvalue≤0.05為標準，找出顯著富集的GO條目，發現這些基因主要和細胞代謝過程相關。通過差異基因表達模式聚類分析得出：6周末上調基因主要與細胞分裂增殖相關，下調基因主要與脂代謝、炎癥因子相關。12周末差異表達基因為2001個，其中上調基因為755個，下調基因為1226個。以correctedpvalue≤0.05為標準，找出顯著富集的GO條目，發現這些基因主要應激反應、免疫過程、細胞代謝過程的調控相關。通過差異基因表達模式聚類分析，筆者得出上調基因主要與免疫、DNA損傷修復相關，下調基因主要與脂代謝、炎癥因子、纖維化功能相關。從中找出特異性差異表達基因，見表1、表2。

表1 6周末差異表達基因

表2 12周末差異表達基因

3 討 論

益氣活血方是由筆者經過多年的臨床實踐研制出來的具有補氣養陰、活血化瘀等功效的方劑，主要用于防治輻射損傷。藥理研究表明，當歸、川芎能對抗輻射損傷；黃芪具有調節免疫、清除自由基的作用［6］；黨參能夠上調細胞外超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的表達［7］；丹參具有抗血小板聚集、改善微循環等作用；苦參能抑制成纖維細胞的增殖活力及DNA合成［8］；香附、當歸、川芎、地龍具有提高機體免疫力、非特異性抗炎等作用［9］。

成纖維細胞生長因子-2可以誘導新生血管的形成［10］，能夠促進骨組織、軟骨組織及神經組織損傷修復和再生［11］。中藥組大鼠肺組織在給藥后6周及12周均有成纖維細胞生長因子受體結合蛋白的高表達，間接表明益氣活血方可以通過增加成纖維細胞因子的表達，從而誘導血管生成，促進組織修復和再生。

腫瘤壞死因子是一種多功能的細胞因子，主要介導免疫及炎癥反應。多數學者認為腫瘤壞死因子、轉化生長因子等誘導的早期炎癥反應及晚期肺纖維化是放射性肺損傷發生的主要機制［1］。中藥組大鼠肺組織在給藥6周、12周時均有腫瘤壞死因子受體基因、低密度脂蛋白受體相關蛋白基因的下調，表明益氣活血方可以減輕減少輻射損傷相關炎癥因子的表達，降低血液黏稠度，從而減輕炎癥反應，改善微循環。

XRCC5及XRCC6均是DNA損傷修復基因，XRCC5是修復DNA雙鏈斷裂的基因，放射線照射后XRCC5的mRNA高表達［12］，輻射抗性小鼠高表達XRCC5基因［13］。益氣活血方應用 12周后可以使 XRCC5、XRCC6基因高表達，表明該藥可以提高大鼠的抗輻射能力，從而減輕輻射損傷。

白介素-17（IL-17）可以刺激粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的分泌，介導免疫系統和造血之間的相互作用，并能夠刺激白介素-6和前列腺素-E2的產生，加強局部炎癥反應［14］。白介素-22（IL-22）在炎癥與免疫反應中發揮重要作用，有研究表明在急性泛發性發疹膿包病中外周血中的IL-22和IL-17表達量明顯提高，它們共同刺激角質細胞產生白介素-8從而促進中性粒細胞在急性泛發型膿皰表皮中聚集［15］。益氣活血方應用12周時IL-17受體基因、IL-22受體基因下調，表明益氣活血方可以調節炎癥相關因子的基因表達，從而減輕放射性損傷。

層黏連蛋白可以結合多種整合素及膠原蛋白，與纖維化形成有關。益氣活血中藥應用12周后可以降低整合蛋白α及層黏連蛋白基因的表達，表明益氣活血方能預防纖維化的形成。

綜上所述，益氣活血方可以調控脂代謝、炎癥因子、免疫功能、DNA損傷修復、纖維化相關基因的表達，從而調節調節機體代謝，加強細胞增殖及分裂，降低血液粘稠度，改善微循環，從而對機體起到保護作用。長期應用可以調節機體免疫功能，降低炎癥相關因子的表達，并提高機體抗輻射能力，有一定的抗纖維化作用。這也是該方具有降低放射性肺損傷發生率，減輕放射性肺損傷，改善患者臨床癥狀及其持續時間的分子生物學機理。

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