參龍湯對腦缺血大鼠血清炎性因子的影響*

陳利平 王發(fā)渭 孫志高 許成勇 黃泉智

（1.解放軍總醫(yī)院海南分院，海南 三亞 572004；2.解放軍總醫(yī)院，北京 100853）

缺血性腦血管病為中老年人常見?。?］。其病理過程包括神經(jīng)細(xì)胞的自身損傷機(jī)制和腦缺血性損傷級聯(lián)反應(yīng)［2］、炎性細(xì)胞因子增加［3］。其中炎性細(xì)胞因子對腦組織神經(jīng)元具有保護(hù)作用［4-5］。筆者既往研究發(fā)現(xiàn)參龍湯具有補(bǔ)腎益氣活血的作用，能提高腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［6］。本研究采用慢性腦缺血動物模型，觀察參龍湯對慢性腦缺血大鼠血清炎性因子含量的影響，探討參龍湯對腦缺血神經(jīng)損傷的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級Wistar大鼠。鼠齡3個月，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半（由解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證編號：SCXK（京）2009-0015。

1.2 藥品、試劑及實(shí)驗(yàn)儀器 參龍湯（由解放軍總醫(yī)院中醫(yī)科提供處方，制劑室制備），吡拉西坦（腦復(fù)康）（石家莊中諾藥業(yè)有限公司），試劑：腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）測定盒均由中國人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所提供，用ELISA法測定IL-6、IL-8、ICAM-1、TNF-α含量，測定按照試劑盒說明嚴(yán)格進(jìn)行。主要儀器Sunrise Romote酶標(biāo)儀 （天津天美國際貿(mào)易有限公司），分析天平，飛鴿離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），恒溫水浴箱，Dy89-1型電動玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 模型制備 根據(jù)文獻(xiàn) ［7］制備慢性腦缺血模型。大鼠禁食12 h，禁水6 h，10%水合氯醛腹腔麻醉（30 mg/100 g）后，仰臥固定在手術(shù)臺上，常規(guī)備皮消毒，剪開頸部皮膚，鈍性分離皮下組織，在氣管旁找到雙側(cè)頸總動脈，0號絲線結(jié)扎。傷口撒頭孢唑啉鈉粉末（0.25 g/只）后逐層縫合。放回籠中飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅分離頸總動脈，不做任何處理。大鼠麻醉蘇醒后常規(guī)飲食飲水。全部造模過程保持大鼠肛溫在37℃，防止低溫的腦保護(hù)作用。

1.4 分組及給藥 60只大鼠造模后排除死亡的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，入選50只。實(shí)施假手術(shù)的10只大鼠設(shè)為對照組，其余大鼠隨機(jī)分為4組：模型組、小劑量參龍湯組、大劑量參龍湯組、腦復(fù)康組，每組10只。術(shù)后3 d開始給藥，參照陳奇［8］的方法，將藥物溶于生理鹽水中，根據(jù)參龍湯和腦復(fù)康的臨床口服用量按體質(zhì)量換算出大鼠相對于人的等效劑量定為小劑量組及對照組的劑量，大劑量參龍湯組的劑量為小劑量參龍湯組的3倍，最終確定小劑量參龍湯組、大劑量參龍湯組和腦復(fù)康組分別含生藥80、240、90 g/L。大鼠灌胃量為1 mL/只，每日1次。假手術(shù)組和模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)4周。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭處死大鼠，在冰面上迅速取腦，分離大腦皮層，生理鹽水沖洗后，稱重、制備成10%的組織勻漿。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有數(shù)據(jù)以（）表示。進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，多個樣本均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清IL-6和IL-8含量比較 見表1。模型組大鼠血清炎性細(xì)胞因子IL-6和IL-8的含量較對照組顯著升高（P<0.05或0.01）。參龍湯能顯著降低血清IL-6、IL-8的含量，大劑量參龍湯組與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 各組大鼠血清IL-6和IL-8含量比較（pg/mL，）

表1 各組大鼠血清IL-6和IL-8含量比較（pg/mL，）

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

2.2 參龍湯對腦缺血大鼠血清TNF-α和ICAM-1的影響 見表2。與對照組比較，模型組大鼠血清TNF-α和ICAM-1含量顯著升高（P<0.05或0.01）。與模型組比較，大劑量參龍湯組能顯著降低TNF-α和ICAM-1的含量（P<0.05）。

表2 各組大鼠血清TNF-α、ICAM-1含量比較（）

表2 各組大鼠血清TNF-α、ICAM-1含量比較（）

3 討 論

慢性腦缺血是神經(jīng)系統(tǒng)的一種常見病理狀態(tài)，是由多種因素參與的復(fù)雜病理過程［9］。缺血性腦血管病導(dǎo)致的神經(jīng)功能損傷的重要機(jī)制之一是缺血后引起的腦組織神經(jīng)元損傷，慢性炎癥在腦動脈硬化的過程中起重要的作用［10］，腦缺血時氧自由基和其他介質(zhì)激活炎性細(xì)胞因子和致炎癥酶原引起趨化因子釋放。TNF-α在缺血損傷后引起的白細(xì)胞浸潤和組織損傷中起重要作用，可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子和細(xì)胞黏附分子釋放、增加表達(dá)，參與腦梗死發(fā)生發(fā)展過程［11］，還能使興奮性氨基酸釋放增加，產(chǎn)生神經(jīng)損傷［12］。IL-6、IL-8能夠誘導(dǎo)其他炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，參與機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血病理過程中，機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)、細(xì)胞因子的釋放起著重要作用［13］。腦缺血的免疫炎癥反應(yīng)是以 IL-6、IL-8、ICAM-1、TNF-α 等細(xì)胞因子為代表的多種炎性介質(zhì)失控后大量釋放而形成的“瀑布效應(yīng)”，各種細(xì)胞因子相互作用，相互促進(jìn)共同加劇了腦組織的廣泛損傷［14］。炎性細(xì)胞因子能誘導(dǎo)其他炎性介質(zhì)產(chǎn)生黏附分子的表達(dá)、白細(xì)胞浸潤的增加、誘導(dǎo)興奮性氨基酸和自由基產(chǎn)生，啟動多種細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)等，在神經(jīng)組織早期炎癥反應(yīng)中對中性粒細(xì)胞具有趨化活性和激活作用引起中性粒細(xì)胞在缺血灶的聚集造成組織損傷；還能生成氧化代謝產(chǎn)物釋放細(xì)胞內(nèi)酶促進(jìn)神經(jīng)組織的炎性反應(yīng)，引起多核白細(xì)胞聚集和激活并釋放炎癥介質(zhì)因此如果通過各種措施阻斷的表達(dá)能減少缺血性神經(jīng)元損傷［15］。

筆者研究結(jié)果顯示：正常大鼠血清細(xì)胞因子IL-6、IL-8、ICAM-1、TNF-α 基礎(chǔ)含量較低，腦缺血模型組IL-6、IL-8、ICAM-1、TNF-α 含量顯著增高， 提示炎性細(xì)胞因子參與腦缺血損傷過程；參龍湯大劑量組IL-6、IL-8、ICAM-1、TNF-α 含量呈現(xiàn)不同程度下降，說明參龍湯可減少血清中炎性因子的含量，這可能是參龍湯對腦缺血神經(jīng)損傷的保護(hù)作用機(jī)制之一。

參龍湯由生曬參、制首烏、淫羊藿、干地龍、石菖蒲、川芎、遠(yuǎn)志等藥物組成。其中君藥人參大補(bǔ)元?dú)?、安神益智。臣藥制首烏補(bǔ)血養(yǎng)肝、益精固髓；淫羊藿溫腎壯陽，二者配伍切合了腎精不足的基本病機(jī)。佐以地龍、川芎活血行氣通絡(luò)，去除腦絡(luò)之瘀阻。石菖蒲、遠(yuǎn)志開竅寧心安神。全方共奏補(bǔ)腎填精、益氣活血、安神增智的功效。前期臨床研究表明，參龍湯對于腦缺血及VD具有較好的療效，并能改善大鼠神經(jīng)功能缺失癥狀，增加大鼠海馬血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，減輕大鼠腦缺血神經(jīng)元的損傷［16-17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：參龍湯大劑量組可降低炎性細(xì)胞因子的含量，對大鼠腦缺血損傷有保護(hù)作用。

［1］蒲傳強(qiáng)，郎森陽，吳衛(wèi)平.腦血管病學(xué)［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2008：117-118.

［2］廖維靖，F(xiàn)rank WUD.腦缺血損傷的病理生理機(jī)制-損傷級聯(lián)反應(yīng)［J］.國外醫(yī)學(xué)：腦血管疾病分冊，1998，4（6）：197-202.

［3］龔非力.醫(yī)學(xué)免疫學(xué) ［M］.3版.北京： 科學(xué)出版社，2009：46-47.

［4］王霞，劉素梅，韓紅偉，等.通絡(luò)中藥對血管性癡呆大鼠細(xì)胞因子表達(dá)的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2009，7（11）：1312-1313.

［5］馬云枝，莊志江，張銘，等.復(fù)智膠囊對血管性癡呆大鼠血清 TNF-α、IL-6 影響的研究［J］.中醫(yī)研究，2006，19（12）：15-17.

［6］陳利平，王發(fā)渭，韓志濤，等.參龍湯對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響［J］.中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2007，13（5）：419-420.

［7］葉翠飛，白容，劉匯波，等.雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎對大鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)血流量的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào)，1999，7（1）：23-25.

［8］陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：1167-1170.

［9］韓濟(jì)生.神經(jīng)科學(xué)［M］.3版.北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2009：299-303.

［10］Banach M，Markuszewki L，Zaslonka J，et al.The role of inflammation in the pathogenesisi［J］.Przegl Epidemiol，2004，58（4）：663-670.

［11］劉尊敬，楊期東.腦梗死患者血清IL-6和ICAM-1變化及臨床意義［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2004，29（3）：326-329.

［12］李力仙，樸明學(xué)，江濤，等.大鼠腦缺血再灌注后缺血側(cè)半球皮質(zhì)與缺血核心區(qū)皮質(zhì)TNF-α含量的對比研究［J］.中國急救醫(yī)學(xué)，2002，22（6）：318-319.

［13］馬昱，陳婕.細(xì)胞因子在腦缺血損傷中的作用［J］.中國臨床醫(yī)學(xué)，2002，9（1）：95-97.

［14］徐曉曉，周江堡.對新生鼠缺血缺氧性腦損傷的保護(hù)作用的研究［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，35（11）：1642-1645.

［15］王麟鵬，程金蓮，張露芬，等.“賀氏三通法”針刺治療對腦缺血再灌注大鼠血清IL-1及TNF-α含量的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2010，19（5）：814-816.

［16］CHEN Liping，WANG Fawei，ZUO Fang.Clinical research on comprehensive treatment of senile vascular dementia［J］.J of Traditional Chinese Medicine，2011，31（3）：33-35.

［17］陳利平，趙桂景，王發(fā)渭，等.參龍湯對腦缺血大鼠血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2012，21（10）：1587-1589.