《金匱》腎氣丸對阿爾茨海默病模型大鼠額葉皮質神經元NT-3表達的影響*

魏良浩 潘 慶 張躍明

（1.浙江中醫藥大學基礎醫學院，浙江 杭州 310053；2.浙江省立同德醫院，浙江 杭州 310012）

阿爾茨海默病（AD）也稱老年性癡呆癥，是發生在老年期及老年前期的一種原發性退行性腦病，主要障礙表現在記憶上，患者關于自己記憶能力的知識受損，從而不能及時更新個人數據庫，被認為與額葉有關［1］。神經營養因子-3（NT-3）廣泛分布在中樞神經系統內，具有阻止胚胎期和出生后運動神經元細胞死亡、支持感覺和運動神經元的存活等功能，給記憶障礙的老齡鼠注射NT-3，有助于其記憶能力的恢復。在阿爾茨海默病中NT-3 Gly（63）～Glu突變明顯高于正常人［2］。因此，本實驗通過對AD大鼠額葉皮質的NT-3陽性細胞數進行分析，研究《金匱》腎氣丸對AD的防治作用。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性清潔級SD大鼠30只，體質量（250±20）g，購于浙江中醫藥大學動物實驗中心。

1.2 藥物與試劑 《金匱》腎氣丸（生地黃24 g，山茱萸肉 12 g，山藥 12 g，牡丹皮 9 g，澤瀉 9 g，桂枝 12 g，淡附子12 g）購于浙江中醫藥大學第一門診部，煎成3 g/mL藥液，放入無菌容器中4℃保存備用。Aβ25-35peptide（北京博奧森生物技術公司），一抗NT-3（武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1293），即用型SP試劑盒 （上海長島生物技術有限公司，編號：D-3005），DAB顯色試劑盒 （上海長島生物技術有限公司，編號：FL-6001）。

1.3 分組與造模 適應性飼養1周后，將大鼠隨機分3組：正常對照組，AD模型組，中藥治療組，每組10只。模型組及中藥治療組大鼠用2%的戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉后，固定在腦立體定位儀上，精確定位右側海馬CA2區 （前囟后 4.2 mm，右側2 mm，深2.6 mm），頭頂備皮，切開皮膚，在顱骨上用牙鉆打孔至海馬區注射點，用10 μL微量注射器一次性注入2 μL 凝聚態的 Aβ25～35 （1 mg的 Aβ25～35 用無菌生理鹽水溶解，-20℃保存，實驗前將Aβ25～35溶液在37℃保溫箱中放置7 d以形成聚集態的Aβ25～35），5 min內注完，留針3 min以保證溶液充分彌散后緩慢撤針。用牙托粉填補針孔，縫合皮膚并消毒。正常對照組在海馬內注射同等劑量的生理鹽水。單籠飼養至大鼠完全清醒。中藥防治組在造模前15 d開始至成模后4周每日以9.9 g/kg的生藥量灌胃，每日1次。正常對照組和AD模型組在造模后給予等量的生理鹽水灌胃。造模成功4周后，大鼠用2%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，經左心室插管快速灌注生理鹽水，同時剪開右心耳，待肝臟變白后，改灌4%多聚甲醛固定液 （用pH7.2～7.4的PBS配制）500 mL至大鼠尾巴變硬為灌注成功，開顱取腦，入相同固定液（4℃）后固定24 h。然后經乙醇梯度脫水，透明，石蠟包埋，選取含額葉皮質的腦塊制作冠狀連續切片。

1.4 標本采集與檢測 每組動物各取7只，每只在相應的額葉部位連續切片，隔五取一，共取15張切片，按照包新民圖譜的B-0.4至B-1.6平面中的Prcl區和Prcm區，在裝有目鏡網格400倍視野下進行陽性細胞計數，計算出0.01 mm2單位面積內的NT-3陽性神經元數目作為NT-3陽性細胞密度。選取各組同一平面含額葉皮質的切片，將切片脫蠟水化（二甲苯3 min×2次，100%酒精 3 min，95%酒精 3 min，80%酒精 3 min，70%酒精3 min，蒸餾水5 min），室溫下將切片放入現配0.3%雙氧水溶液中，室溫孵化7 min滅活內源性酶，放入 Phosphate Buffered Saline（PBS）緩沖液（pH7.2～7.6）洗滌2 min×3次，再進行隔水熱抗原修復，然后按照SP試劑盒說明書進行染色（NT-3一抗濃度：1∶50）， 最后脫水至透明 （70%酒精 3 min，80%酒精 3 min，90%酒精 3 min，95%酒精 3 min，100%酒精 5 min×2次，二甲苯3 min×2次，中性樹膠封片。陰性對照組用Phosphate Buffered Saline（PBS）緩沖液液代替一抗。

1.5 統計學處理 應用SPSS16.0軟件統計分析，所得數據以（）表示。統計各組染色的陽性神經細胞密度，采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況 觀察各組大鼠在術前行為均正常，反應靈敏，正常進食。術后3～6 d后，正常對照組恢復正常，中藥組和AD模型組出現相應的反應遲鈍，精神萎靡，喜靜少動，少食少飲。術后10 d左右，模型組大鼠反應仍舊遲鈍，覓食減少，中藥組較模型組而言，精神癥狀較好，覓食增加。

2.2 各組大鼠額葉皮質NT-3免疫組化結果 見圖1。AD模型組大鼠Prcl和Prcm區中的額葉皮質NT-3神經元數量少（與正常組比較P<0.01），染色淺；正常對照組的Prcl和Prcm區中的額葉皮質NT-3神經元數量多，染色深，輪廓清楚；中藥治療組大鼠與正常對照組接近。目鏡網格法測的的各組大鼠額葉皮質陽性細胞密度見表1。

表1 各組大鼠額葉皮質陽性細胞密度比較（細胞數/0.01 mm2，）

表1 各組大鼠額葉皮質陽性細胞密度比較（細胞數/0.01 mm2，）

與正常對照組比較，*P＜0.01。

圖1 免疫組化結果（×400）

3 討 論

AD患者常有認知功能障礙，主要表現為學習、記憶能力下降。額葉皮質神經元與各葉皮質均有往返聯系，額葉神經元通過抑制無關信息、選擇性注意和語詞輸出等機制介入知覺型聯想啟動和知覺啟動，從而參與學習記憶過程［3］。NT-3是一組與神經結構和功能密切相關的蛋白，其營養信息的傳遞是通過具有高親和力活性的酪氨酸激酶受體來啟動的，調控著神經元的發育、生長、分化和生存，對維持神經系統的正常功能承擔著重要作用［4-5］。本研究結果顯示，NT-3陽性細胞在額葉皮質各層內彌散分布，與正常對照組比較，AD模型組大鼠大腦皮質NT-3陽性神經元數量明顯減少，染色變淺，表明AD大鼠的額葉皮質表達NT-3的神經元發生了退行性變。

《金匱》腎氣丸載于東漢醫家張仲景所著的《金匱要略》，分別主治虛勞、消渴、腳氣、痰飲、轉胞5個病證，乃公認的補腎名方。老年人的生理特點和病理基礎多是腎氣虛損，腎精虧虛，不能生髓充腦，腦失滋養，漸成癡呆，故補腎法是治療老年性癡呆的重要方法。本實驗結果顯示，老年性癡呆模型組大鼠額葉皮質NT-3陽性神經細胞表達減少，陽性細胞密度比正常對照組降低，《金匱》腎氣丸治療組陽性細胞密度與正常對照組接近。因此，筆者推測以額葉皮質Prcl區和Prcm區為代表的老年性癡呆大鼠模型較正常大鼠額葉皮質存在較少的NT-3陽性細胞，《金匱》腎氣丸能夠通過抑制NT-3的陽性細胞的凋亡，起到延緩神經元衰老死亡的作用，從而對老年性癡呆能起到一定的防治作用。增加的NT-3又能降低細胞內活性氧的水平或改變活性氧組份比例起到保護細胞的作用，并通過影響細胞內多種蛋白酶、激酶及其復雜的信號傳遞系統來抑制細胞凋亡的過程［6］。

綜上所述，《金匱》腎氣丸對老年性癡呆大鼠大腦額葉皮質神經元的退變具有一定的防治作用。

［1］陳功香，張莉.老年癡呆患者元記憶研究的大腦機制［J］.中國特殊教育，2009，12（114）：42-50.

［2］來東兵，黃秉仁.神經營養素-3（NT-3）的結構與功能［J］.醫學研究通訊，1999，28（3）：27-29.

［3］Gabrieli JDE，Poldrack RA，Desmond JE.Therole of left prefrontal cortex in language and memory［J］.Proceedings of National Academy of Sience in USA，1998，95：906-913.

［4］Qun LX，Pirvola U，Saarma M，et al.Neurotrophic factors in the auditory periphery［J］.Ann NY Acad Sci，1999，884（2）：292-304.

［5］Hossain WA，Brumwell CL，Morest DK.Sequential interactions of fibroblast growth factor-2，brain-derived neurotrophic factor， neurotrophin-3，and their receptors define criticalperiods in the development of cochlear ganglion cells［J］.Exp Neurol，2002，175（1）：138-151.

［6］郭雨霽，李盛芳.神經營養因子家族及其受體的研究進展［J］.神經解剖學雜志，2001，17（3）：288-294.