痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型制備的研究

李 澤，張記恩，榮 俊 （長(zhǎng)江大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州434000）

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由于尿酸納結(jié)晶體沉積在關(guān)節(jié)腔內(nèi)引起的一種炎癥反應(yīng)，臨床上以腫脹、疼痛、發(fā)熱為主要表現(xiàn)［1］。目前，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率逐漸上升，發(fā)病低齡化，對(duì)其病因與遺傳學(xué)的研究及臨床治療逐漸成為大家重視的問題。但目前痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型的制備尚不成熟，與人類痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制相比穩(wěn)定性較差。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)Mc Carty法造模，建立SPF雞痛風(fēng)模型，評(píng)估人工痛風(fēng)模型建立的效果，以便對(duì)新型藥物治療痛風(fēng)提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，并為臨床上治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎提供新的方向和參照。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF白來(lái)航雞30只 （雄性），雞齡2～3月，體質(zhì)量1800～2500g，代謝籠：由本院提供。實(shí)驗(yàn)室：溫度濕度穩(wěn)定、干潔、通風(fēng)。實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)條件下常規(guī)飼養(yǎng)1周。

1.1.2 主要藥物 尿酸鈉晶體Sigma公司生產(chǎn)；生理鹽水 （美國(guó)Aldrich公司）；PZA （美國(guó)Sigma公司）；苯溴馬璉 （德國(guó)赫曼大制藥廠）。

1.2 動(dòng)物分組與給藥方法

SPF雞實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)條件下常規(guī)飼養(yǎng)1周。SPF雞30只隨機(jī)分為兩組，模型組25只和正常對(duì)照組5只。采用Mc Carty經(jīng)典方法造模，即將SPF雞腿部備皮 （左側(cè)），常規(guī)消毒皮膚，輕度屈曲關(guān)節(jié)，關(guān)節(jié)正中進(jìn)針，將配置好的2%尿酸鈉溶液以0.5ml／kg通過膝關(guān)節(jié)后側(cè)韌帶注入公雞膝關(guān)節(jié)腔。正常對(duì)照組注射等容積生理鹽水。每3d注射1次，連續(xù)注射4次。于注射前、注射后5、24、48h后仔細(xì)觀察受試關(guān)節(jié)的形態(tài)變化 （局部紅腫程度、皮膚溫度變化、關(guān)節(jié)活動(dòng)度），分別詳細(xì)記錄以上4個(gè)階段時(shí)受試關(guān)節(jié)患側(cè)、健側(cè)的周徑及皮膚溫度差值。第6周取血后處死SPF雞，按外科學(xué)鈍性分離法取出受試雞健、患側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨及滑膜組織，切成約1mm厚的切片行病理學(xué)檢查。

1.3 觀察指征

①精神狀態(tài)以及活動(dòng)情況，飲食、體質(zhì)量、毛色、皮溫、關(guān)節(jié)皮色、腫脹程度、行走狀況和關(guān)節(jié)液變化情況等等。②膝關(guān)節(jié)周徑的測(cè)量以及腫脹指數(shù)的計(jì)算。③光學(xué)顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)滑液細(xì)胞種類及數(shù)量以及變化情況。④病理學(xué)報(bào)告以及炎癥程度記分。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況觀察

實(shí)驗(yàn)前1周模型組和正常對(duì)照組精神好，食欲佳，活潑好動(dòng)，毛色光澤，體質(zhì)量按正常增長(zhǎng)。局部常規(guī)注射尿酸鹽后，模型組雞皮毛干枯發(fā)黃，倦怠懶動(dòng)緩慢，進(jìn)食逐漸量少，出現(xiàn)便秘2只，體質(zhì)量逐漸下降3只，其余7只體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢。用藥后觀察1～6h，模型組雞活動(dòng)、攝食水明顯減少，關(guān)節(jié)局部膚溫升高，正常對(duì)照組于實(shí)驗(yàn)前無(wú)明顯差異；模型組與實(shí)驗(yàn)前相比變化顯著。正常對(duì)照組5只步態(tài)均為0級(jí)，而模型組25只步態(tài)呈現(xiàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)分別為12、6、7只，無(wú)0級(jí)步態(tài)。

圖1 正常軟骨組織

2.2 兩組關(guān)節(jié)周徑變化

兩組關(guān)節(jié)周徑變化見表1。正常對(duì)照組用藥前后關(guān)節(jié)周徑差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），模型組用藥后周徑增加明顯，用藥前后比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。模型組關(guān)節(jié)周徑增加明顯，高于正常對(duì)照組（P＜0.05），表明局部注射尿酸鹽較好地復(fù)制痛風(fēng)模型。

表1 造模前后各組關(guān)節(jié)周徑變化

2.3 組織病理改變

正常對(duì)照組：病理學(xué)改變不明顯，關(guān)節(jié)周圍組織結(jié)構(gòu)正常 （見圖1、2、3）。

模型組：明顯的關(guān)節(jié)炎病理改變，關(guān)節(jié)周圍異物肉芽腫形成，其間有大量異物多核巨細(xì)胞，成纖維細(xì)胞增生，毛細(xì)血管增生，排列紊亂。尿酸鹽結(jié)晶可在標(biāo)本取出時(shí)大體觀察到 （如圖4、5）。

圖3 正常腎小管上皮細(xì)胞

圖4 病變軟骨組織

模型組電鏡顯示：腎近曲小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞表面微絨毛形態(tài)不規(guī)則；正常對(duì)照組：腎小管上皮細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)正常 （圖6）。X線下可見：正常對(duì)照組關(guān)節(jié)間隙正常，無(wú)鈣化影，無(wú)骨質(zhì)破壞，關(guān)節(jié)面平整 （圖7）；模型組可見關(guān)節(jié)間隙狹窄，骨質(zhì)破壞，可見不規(guī)則團(tuán)塊狀鈣化影 （圖8）。

圖5 病變滑膜組織

圖6 病變腎小管上皮細(xì)胞

圖7 正常X線表現(xiàn)

圖8 病變X線表現(xiàn)

2.4 血尿酸水平的變化

用藥前，各組SPF雞血尿酸水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。用藥后，模型組SPF雞血尿酸值由（108.9±10.11）μmol／L升高到 （301.8±24.7）μmol／L，與用藥前比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0.05）。表明局部注射尿酸鹽可以復(fù)制痛風(fēng)發(fā)作模型，為臨床治療痛風(fēng)打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3 討 論

痛風(fēng)是一種代謝性疾病。成人血尿酸的正常濃度為90～420μmol／L，其水溶性差，超過此范圍即會(huì)形成結(jié)晶，沉積后引起一系列臨床癥狀。近年來(lái)，隨著痛風(fēng)發(fā)病率的逐年增多，對(duì)痛風(fēng)的研究日益受到重視。

尿酸是天然抗氧化劑的代表。施心猷等［2］研究證實(shí)其保護(hù)臟器、血管內(nèi)皮細(xì)胞DNA，延緩器官老化，根本原因是它可以清除氧自由基。同時(shí)可以延遲淋巴細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。楊春生等［3］在臨床工作中還發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥與慢性疾病有關(guān)，例如高血壓、冠心病等。所以對(duì)高尿酸血癥的研究臨床綜合治療和研究各種醫(yī)學(xué)現(xiàn)象有重要意義。痛風(fēng)是由于尿酸代謝失衡的結(jié)果，如尿酸產(chǎn)生過多和／或排泄減少，使血尿酸在血液中蓄積，就會(huì)引發(fā)痛風(fēng)的相關(guān)癥狀。由于體內(nèi)存在尿酸酶，所以人類與SPF雞在尿酸代謝方面存在著顯著差異。因此只有消除這種差異才能達(dá)到動(dòng)物模型與人類痛風(fēng)相似的目的，目前主要的方法是破壞胚胎干細(xì)胞的尿酸酶基因，從而引發(fā)痛風(fēng)，但是由于這種方法使動(dòng)物腎臟損害非常嚴(yán)重，因此死亡率高，此外，這種方法操作復(fù)雜，技術(shù)要求高，限制了其應(yīng)用和發(fā)展。因此應(yīng)用尿酸酶的方法建立痛風(fēng)模型成為主要方法，但依然與人類疾病有著重要差別。

動(dòng)物模型的建立是尋求新型治療藥物和探究疾病機(jī)理的有效途徑，而建立可靠的高尿酸血癥動(dòng)物模型是研究痛風(fēng)及其相關(guān)疾病發(fā)病、新型治療方法的基礎(chǔ)［4］。因此對(duì)于痛風(fēng)的研究也應(yīng)建立在動(dòng)物模型的基礎(chǔ)之上，它是尋找新型治療方案的基礎(chǔ)。動(dòng)物模型設(shè)計(jì)［5］應(yīng)首先遵循可靠、適用、相似、再現(xiàn)、可控及易行性等原則，而評(píng)價(jià)則從模型癥狀、表現(xiàn)、病理變化、反證治療以及模型穩(wěn)定性等方面進(jìn)行。周小舟等［6］研究發(fā)現(xiàn)人類缺乏尿酸酶基因，從而導(dǎo)致體內(nèi)缺乏尿酸酶，而大多數(shù)動(dòng)物包括哺乳類動(dòng)物體內(nèi)普遍存在尿酸酶，能將尿酸進(jìn)一步分解為尿囊素，尿囊素?zé)o毒、水溶性良好，極易隨尿排出體外，所以血尿酸水平較低。尿酸是人類嘌呤核苷酸代謝終產(chǎn)物，如果嘌呤代謝發(fā)生障礙往往會(huì)伴隨血尿酸水平升高。國(guó)內(nèi)外大量研究［7］證實(shí)，人類和禽類嘌呤核苷酸的代謝途徑極其相似，其終產(chǎn)物尿酸的合成和代謝方面與有共同之處 （核酸在降解過程中也能產(chǎn)生嘌呤類化合物，最終生成血尿酸），所以伴隨飲食中蛋白質(zhì)和核蛋白增加時(shí)，體內(nèi)尿酸的生成隨之增加。在動(dòng)物選擇方面，除了種屬之外，還包括性別以及年齡。國(guó)內(nèi)學(xué)者何力群實(shí)驗(yàn)證明雌雄動(dòng)物無(wú)明顯差異［8］，但是在實(shí)際操作中，一般選用雄性動(dòng)物，因?yàn)橥詣?dòng)物之間，血尿酸正常值差異較大，雌鼠尤為明顯，這可能與雌性動(dòng)物激素分泌波動(dòng)有關(guān)。為消除年齡因素，在實(shí)驗(yàn)中通常選用機(jī)體各項(xiàng)機(jī)能正常的年輕動(dòng)物。SPF雞飼養(yǎng)方便，是常用的實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物。

我們將一定濃度的尿酸鈉液注入關(guān)節(jié)腔造成急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，其局部表現(xiàn)、關(guān)節(jié)液檢查和病理與人類疾病極為相似。在1961年，有研究證實(shí)MSU晶體存在于痛風(fēng)患者關(guān)節(jié)內(nèi)，并把尿酸鈉晶體注入狗的關(guān)節(jié)后成功的誘發(fā)急性關(guān)節(jié)炎，標(biāo)志著痛風(fēng)研究史上的里程碑［9］。MSU誘發(fā)的急性突發(fā)性關(guān)節(jié)炎是國(guó)際上常用的GA模型［10］。尿酸在體液中的溶解度很低 （尿酸最高溶解度是0.385mmol／L），在它飽和后會(huì)形成結(jié)晶，結(jié)晶以尿酸鹽的形式沉積于正常含有大量粘多糖的結(jié)締組織中，如關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)、滑膜內(nèi)和其他組織，由于這些組織中血管存在較少，組織液pH比較低，便于尿酸鹽沉積。實(shí)驗(yàn)證實(shí)雞膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入配置好的MSU液后，關(guān)節(jié)炎癥狀迅速出現(xiàn)［11］。藥物注射后4h后關(guān)節(jié)炎已經(jīng)有明顯表現(xiàn)，關(guān)節(jié)腔積液和關(guān)節(jié)周圍組織含有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。實(shí)驗(yàn)表明，注射后4h與注射后12、24、48h雞膝關(guān)節(jié)皮膚溫度差異顯著。其關(guān)節(jié)腫脹與跛行步態(tài)可在48h內(nèi)自行輕微緩解。為達(dá)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模蛊涓先祟愅达L(fēng)性關(guān)節(jié)炎的特性，故反復(fù)注射。

通過實(shí)驗(yàn)可觀察到模型組用藥后雞單側(cè)的膝關(guān)節(jié)膚溫升高，局部紅腫較明顯，關(guān)節(jié)液質(zhì)濁、量多、色淺微黃，關(guān)節(jié)周徑增大，食量減少，伴隨明顯的跳躍步態(tài)。病理組織改變明顯，光學(xué)顯微鏡下可見尿酸鈉晶體沉積于關(guān)節(jié)及其周圍，血液分析可見白細(xì)胞明顯增多，與對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明尿酸鈉誘導(dǎo)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型造模成功。本實(shí)驗(yàn)通過 （單側(cè)膝關(guān)節(jié)）腔隙注射尿酸鈉溶液，建造出較為成熟穩(wěn)定的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型，給痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的研究、尋找新的抗痛風(fēng)藥物以及抗痛風(fēng)藥物的作用帶來(lái)參考和對(duì)照。