食用黑粉菌侵染對茭白植株抗氧化系統(tǒng)和葉綠素熒光的影響

閆 寧，王曉清，王志丹，張艷麗，薛惠民，郭得平

(浙江大學農業(yè)與生物技術學院園藝系，杭州 310058)

植物與微生物之間的互作是生物科學研究的熱點領域之一。植物可以通過氧爆發(fā)迅速產生大量的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，如超氧自由基()和過氧化氫(H2O2)，以應對病原菌的早期侵染［1］。同時，植物體內的ROS代謝系統(tǒng)平衡受病原菌侵染而破壞，引起膜質過氧化，破壞膜結構［2-3］。丙二醛(MDA)產生是植物細胞膜質過氧化的一個重要指標，它能與植物細胞內的各種成分發(fā)生反應，從而導致蛋白質、核酸等的氧化破壞和葉綠素降解［4］。ROS產生雖然可以加重侵染導致的有害氧化脅迫效應，但也可參與植物對抗病原菌的防衛(wèi)反應，而ROS清除酶(抗氧化酶)活性提高是這些防衛(wèi)反應的基礎。其中，抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)等在植物的抗病防御過程中起著重要的保護作用［5-8］。這些抗氧化酶的協(xié)調作用能有效地清除ROS，防止膜質過氧化，從而使細胞免受或減輕其傷害。

葉綠素熒光參數(shù)可以快速反映植物葉片光化學效率的變化，在了解葉片光合作用過程中光系統(tǒng)對光能的吸收、傳遞、耗散和分配等方面具有獨特作用［9-10］。因此，葉綠素熒光技術被廣泛用來研究病原菌侵染對植物光化學效率的影響。研究表明，病原菌侵染會導致植物葉片的光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)受到傷害，表現(xiàn)為Fv/Fm下降;同時，PSⅡ實際光化學效率下降，表現(xiàn)為ΦPSⅡ下降;而NPQ增加，說明植物葉片吸收的光能用于光化學猝滅的比例增加，相應用于光化學反應的比例減少，即光化學效率降低［11-13］。例如，擬南芥被白銹菌(Albugo candida)侵染后，ΦPSⅡ的降低和NPQ的上升與可見癥狀出現(xiàn)的時間和程度緊密相關［11］。被葡萄生單軸霉菌(Plasmopara viticola)侵染的葡萄葉片的 Fv/Fm和 ΦPSⅡ均降低［12］。同樣，Aldea等［13］發(fā)現(xiàn)尾孢屬(Cercospora)和葉點霉屬(Phyllosticta)真菌侵染會導致植物葉片ΦPSⅡ降低。當植物光合作用被抑制后，葉片的過剩激發(fā)能就會增加，植物如果不能及時清除這些過剩激發(fā)能，就會導致ROS產生，進而引起PSⅡ的光破壞［14］。

茭白膨大莖是我國的一種重要水生蔬菜，是由食用黑粉菌(Ustilago esculenta)(又稱茭白黑粉菌)侵染茭白植株后誘導產生的［15-17］，兩者的互作是真菌與植物互作一種非常有趣且重要的形式。雖然食用黑粉菌侵染導致茭白莖的過度膨大，但未對生長造成明顯影響，也未導致葉片失綠或者壞死，與內生真菌相似［18］。已有研究報道了茭白肉質莖膨大期間SOD、POD、CAT等幾種酶的活性變化［19-20］，表明肉質莖膨大期間食用黑粉菌的活動可造成莖組織氧化脅迫程度逐漸加重［21］。然而，迄今為止，食用黑粉菌侵染后茭白葉片的抗氧化特性、葉綠素熒光參數(shù)變化未見報道。

植物體中存在的抗氧化酶在清除ROS中發(fā)揮了重要作用［1］，而MDA含量可反映ROS導致的膜質過氧化程度［4］;葉綠素熒光參數(shù)可以反映植物葉片PSⅡ光化學效率的變化［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)，植物受病原菌侵染后表現(xiàn)出ROS的大量形成(即氧迸發(fā))［1］，膜質過氧化加重［2-3］和光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)破壞［11-13］;然而，內生真菌侵染后，植物表現(xiàn)出膜質過氧化減輕［22-25］，且PSⅡ未受破壞等現(xiàn)象［26-27］。食用黑粉菌與茭白植株互作的機制目前不太清楚，它如何影響茭白葉片ROS的產生和抗氧化酶的活性?如何影響茭白葉片光能的吸收、傳遞、耗散和分配?本研究擬通過測定茭白葉片的抗氧化酶活性、產生速率、H2O2含量、MDA含量和葉綠素熒光等生理指標的變化，了解食用黑粉菌-茭白植株互作的性質和意義，也為深入研究真菌-植物互作的生理生化機制提供基礎。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

本試驗在浙江大學紫金港校區(qū)溫室進行。試驗材料為茭白(Zizania latifolia Turcz．)，品種為“浙茭2號”(雙季茭)。茭白植株種植于桶(30 cm×30 cm)內。試驗所用的土壤為砂壤土，土壤有機質含量為11．9g/kg、堿解氮含量為92．5mg/kg、速效磷含量為25．6mg/kg、速效鉀含量為75．9mg/kg。桶內保持10 cm左右的水層。試驗期間，及時進行施肥和病蟲害防治。

1．2 試驗設計

本試驗選用長勢良好、大小一致的植株。食用黑粉菌侵染的茭白植株和對照植株各16桶，每桶種植1墩(約10株)。對照植株為從“浙茭2號”材料中自然分化出來的未受食用黑粉菌侵染的植株［17，28］。移栽后第1周(葉片長15cm)開始測定，剪取植株從上往下數(shù)的第3片葉，用于抗氧化特性和葉綠素熒光的測定。以后每隔1周測定1次，共測定6次，每次測定至少重復6次。

1．3 測定指標與方法

1．3．1 形態(tài)學指標的測定

移栽后第6周，測定植株的株高、葉長、葉寬、葉片厚度、葉數(shù)、分蘗數(shù)和根長，同時測定每株茭白的莖重量、根系重量(R)和地上部重量(S)，并計算根冠比(R/S)。

1．3．2 抗氧化特性的測定

取0．2g葉片加入3mL磷酸緩沖液提取，提取液包含 50mmol/L磷酸鈉(pH7．8)，0．2 mmol/L EDTA，2 mmol/L還原型抗壞血酸和2%聚乙烯吡咯烷酮。12 000g離心20 min，上清液用于抗氧化特性的測定。抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽還原酶(GR)、超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定參照Lee和Lee［29］的方法。超氧自由基()產生速率的測定參照王愛國和羅廣華［30］的方法。葉片組織H2O2含量測定參照Brennan和Frenkel［31］的方法。MDA含量測定參照Stewart和Bewley［32］的方法。

1．3．3 葉綠素熒光的測定

PSⅡ最大光化學量子產量(Fv/Fm)、PSⅡ實際光化學效率(ΦPSⅡ)、非光化學淬滅(NPQ)和電子傳遞速率(ETR)等參數(shù)用M-Series Imaging-PAM熒光成像系統(tǒng)(Walz，Effeltrich，Germany)測定，測定前植株葉片在室溫(25℃)條件下先暗適應30分鐘。暗適應之后，用0．5 μmol/m2的光強來測定Fo(PSⅡ反應中心處于完全開放時的熒光產量)，用2800 μmol·m-2·s-1的光強來測定Fm(PSⅡ反應中心完全關閉時的熒光產量)。PSⅡ最大光化學量子產量(Fv/Fm)測定時選定整個葉面積為AOI(Area of Interest)，計算Fv/Fm的平均值。Fv/Fm的具體的計算方法是:Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm。Kinetics測定時的作用光強度設置為146 μmol·m-2·s-1，20s一個脈沖，如此循環(huán)持續(xù)5min后，得到ΦPSⅡ、NPQ和ETR值。ΦPSⅡ、NPQ和ETR值是通過軟件Imaging-WIN輸出的。具體的計算方法是:ΦPSⅡ=(Fm'-Fs)/Fm'，NPQ=Fm/Fm'-1，而ETR=(Fm'-Fs)/Fm'×PAR×0．5×0．84。其中，F(xiàn)o是PSⅡ反應中心處于完全開放時的熒光產量，F(xiàn)m是PSⅡ反應中心完全關閉時的熒光產量，F(xiàn)m'是作用光打開時的最大熒光產量，F(xiàn)s是穩(wěn)態(tài)的熒光產量。

1．4 統(tǒng)計分析

試驗結果用Excel整理，所有數(shù)據(jù)在P ＜0．05水平下進行t檢驗。試驗中所有的分析過程在SPSS17．0統(tǒng)計分析程序中完成。

2 結果與分析

2．1 生長指標

對照植株的株高、葉長、葉寬、葉片厚度、根長、莖鮮重、根鮮重、地上部鮮重顯著高于侵染植株的(P＜0．05)，但葉數(shù)、根冠比(R/S)與侵染植株的無顯著差異(P ＞0．05)，同時分蘗數(shù)顯著低于侵染植株(P＜0．05)(表1)。對照植株的株高、葉長、葉寬、葉片厚度、根長、莖鮮重、根鮮重、地上部鮮重分別比侵染植株的高 63．5%、39．0%、63．6%、28．6%、46．8%、36．7%、53．9%，但其分蘗數(shù)僅是侵染植株的 57．4%。

表1 食用黑粉菌侵染對茭白植株生長的影響Table 1 Growth of Zizania latifolia plants after infection by Ustilago esculenta

2．2 抗氧化特性

2．2．1 抗氧化酶活性

從圖1可以看出，隨著移栽時間的增加，侵染植株和對照植株的抗氧化酶活性均呈升高趨勢。移栽后第1周，侵染植株葉片的APX、CAT、POD、GR和SOD活性高于對照植株的，但差異不顯著(P ＞0．05)。移栽后第2周到第6周，侵染植株葉片的APX、CAT、POD、GR和SOD活性顯著高于對照植株的(P ＜0．05)。

從結果看出，移栽后，對照植株和侵染植株的O2·-產生速率和H2O2含量均呈增加趨勢，且對照植株葉片的 O2·-含量顯著高于侵染植株的(P＜0．05)(圖2)。從第1周到第6周，對照植株葉片的O2·-產生速率分別比對照植株高 20．2%、18．1%、18．9%、14．6%、12．5%、18．1%。移栽后第 1 周，侵染植株葉片的 H2O2含量高于對照植株的，但差異不顯著(P ＞0．05);移栽后第2周到第6周，侵染植株葉片的H2O2含量顯著高于對照植株的(P ＜0．05)(圖2)。

2．2．3 MDA 含量

試驗結果表明，移栽后，對照植株和侵染植株的MDA含量呈增加趨勢，且對照植株葉片的MDA含量顯著高于侵染植株(P＜0．05)(圖3)。從第1周到第6周，對照植株葉片的MDA含量分別比侵染植株的高12．9%、20．8%、19．3%、16．1%、16．2%、18．5%。

2．3 葉綠素熒光

Fv/Fm是PSⅡ最大光化學量子產量，表示最大光化學效率，它在非脅迫條件下變化極小，是反映PSⅡ光化學效率的穩(wěn)定指標。本試驗結果表明，侵染植株葉片的Fv/Fm和對照植株幾乎無差異(P ＞0．05)(圖4)。

ΦPSⅡ是PSⅡ實際光化學效率，它是葉片用于光合電子傳遞的能量占所吸收光能的比例，常用來表示植物光合作用的電子傳遞量子產額。本實驗結果顯示，侵染植株葉片的ΦPSⅡ大于對照植株的，但差異不顯著(P＞ 0．05)(圖 4)。

圖1 食用黑粉菌侵染對茭白葉片抗氧化酶活性的影響Fig．1 Antioxidant enzyme activities in leaves of Zizania latifolia after infection by Ustilago esculenta

NPQ是非光化學猝滅，反映了PSⅡ天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散掉的部分。本實驗結果表明，對照植株葉片的NPQ大于侵染植株的，但差異不顯著(P ＞0．05)(圖4)。同時，侵染植株葉片的電子傳遞速率(ETR)大于對照植株的，但差異不顯著(P ＞0．05)(圖4)。

3 討論

3．1 食用黑粉菌侵染對茭白植株生長的影響

本研究的結果表明，食用黑粉菌(U．esculenta)侵染抑制了茭白植株的生長，表現(xiàn)為株高、葉長、葉寬、葉片厚度、根長、莖重量、根重量、地上部重量降低(P＜0．05)(表1)，這一結果和很多植物受病原菌侵染后表現(xiàn)的癥狀相似［33-34］，但不同于某些內生真菌對植物生長的促進作用，如印度梨形孢(Piriformospora indica)和叢枝菌根(AM)真菌中的摩西球囊菌(Glomus mosseae)侵染導致玉米株高增加［35］，菌刺孢屬(Mycocentrospora)內生真菌侵染雪蓮花(Saussurea involucrata)顯著提高了植物的株高、根數(shù)和生物量［27］。

有趣的是，我們觀察到食用黑粉菌侵染顯著提高了茭白的分蘗數(shù)(P＜0．05)(表1)。這一結果與內生真菌Acremonium lolii侵染可導致多年生黑麥草(Lolium perenne)分蘗數(shù)增加的現(xiàn)象一致［36］。食用黑粉菌侵染促進茭白植株分蘗數(shù)的增加可能和其分泌的植物激素有關，如生長素、細胞分裂素等［37-40］，因為植物激素可以調節(jié)植物的形態(tài)建成［41］。

圖2 食用黑粉菌侵染對茭白葉片超氧自由基(O2·－)產生速率和過氧化氫(H2O2)含量的影響Fig．2 formation rate and H2O2content in leaves of Zizania latifolia after infection by Ustilago esculenta

3．2 食用黑粉菌侵染調節(jié)茭白植株體內的抗氧化平衡狀態(tài)

本試驗結果表明，食用黑粉菌侵染導致茭白葉片中APX、CAT活性增強(P＜0．05)(圖1)。高的APX活性會提高AsA的含量，有利于清除植株組織中的ROS;同時，CAT清除H2O2被認為可能是植物應對病原菌防衛(wèi)反應的高效機制［42］。已有報道也發(fā)現(xiàn)大麥和白粉菌(Blumeria graminis sp．hordei)的親和互作中，CAT活性顯著增加［6］。同樣，內生真菌 Acremonium lolii侵染導致黑麥草葉片APX活性顯著增加［36］。SOD作為植物抗氧化體系的第一道防線，可以將超氧自由基()歧化產生H2O2和O2，抑制膜質過氧化作用［32］。本研究中觀察到侵染植株葉片中SOD活性高于對照植株的(圖1)，所以侵染植株的含量低于對照植株(圖2)。這與前人報道的叢枝菌根(AM)真菌侵染導致植株SOD活性增高的結果一致［22-25］。肉質莖膨大過程中，CAT和SOD活性呈下降趨勢，說明茭白肉質莖膨大是食用黑粉菌引起的茭白莖尖的感病過程［19-20］。GR是AsAGSH循環(huán)中的一種關鍵酶，在NADPH的作用下，催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原為還原型谷胱甘肽(GSH)［43］。本研究發(fā)現(xiàn)，食用黑粉菌侵染后，茭白葉片GR活性提高(P＜0．05)(圖1)。這種變化與早期報道的印度梨形孢(P．indica)-大麥互作中的GR活性提高的結果相一致，說明茭白葉片有較高水平的還原型谷胱甘肽，利于提高細胞的抗氧化能力［8］。本研究觀察到食用黑粉菌侵染后茭白葉片POD活性升高(P＜0．05)(圖1)，這種增高既可能與食用黑粉菌大量繁殖帶來氧化脅迫的保護性反應有關，又可能與細胞、組織的分化以及細胞膨大過程中木質素的形成有關［19-20］。

圖3 食用黑粉菌侵染對茭白葉片丙二醛(MDA)含量的影響Fig．3 MDA content in leaves of Zizania latifolia after infection by Ustilago esculenta

圖4 食用黑粉菌侵染對茭白葉片葉綠素熒光的影響Fig．4 Chlorophyll fluorescence in leaves of Zizania latifolia after infection by Ustilago esculenta

在植物正常生命過程中，植物細胞存在ROS的產生和清除兩個過程。病原菌侵染會促進ROS的產生、引起膜質過氧化等變化［1-3］。植物體內的各種抗氧化酶在清除植物細胞產生的ROS中發(fā)揮重要作用［5-8］。本研究的結果顯示，食用黑粉菌侵染降低了茭白葉片的超氧自由基()產生速率(P＜0．05)(圖2)，同時提高了抗氧化酶活性(圖1)，對有效清除侵染植株組織內的ROS十分有利，因此導致膜脂過氧化產物MDA含量降低(圖3)(P＜0．05)，表明ROS導致的膜質過氧化程度下降［4，32］。另外，膜脂過氧化引起葉綠體超微結構的損傷，葉綠素的降解和光合酶活性下降，降低植物光合能力［4，28］。另外，食用黑粉菌侵染提高了茭白葉片的H2O2含量(P＜0．05)(圖2)。侵染植株中 H2O2的升高可能與在SOD的作用下轉化成H2O2和O2有關［32］。這與劉偉等［21］報道的肉質莖膨大期間食用黑粉菌的快速繁殖造成H2O2含量快速上升，內生真菌Gilmaniella侵染蒼術(Atractylodes lancea)幼苗促進H2O2含量提高的結果一致［44］。茭白肉質莖開始膨大后，抗氧化劑AsA和GSH不能有效清除肉質莖膨大產生的ROS，莖中的H2O2含量快速上升［21］，這可能與CAT和SOD 活性下降有關［19-20］。

與病原菌侵染的植物葉片表現(xiàn)出膜脂過氧化(MDA含量)升高的報道不同［2-3］，本研究表明，食用黑粉菌侵染減輕了茭白葉片的膜質過氧化程度，即MDA含量降低(圖3)，這與已報道的叢枝菌根(AM)真菌侵染植株［22-25］和Neotyphodium屬內生真菌侵染植株MDA含量下降的結果一致［45］。

3．3 食用黑粉菌侵染對茭白葉片葉綠素熒光的影響

Fv/Fm反映PSⅡ反應中心的原初光能轉化效率，是反應植物脅迫程度的常用指標［9-10］。已有研究顯示病害脅迫會使植物的PSⅡ受到傷害［12］，而叢枝菌根(AM)真菌中的聚生球囊菌(G．fasciculatum)和菌刺孢屬(Mycocentrospora)內生真菌侵染并不顯著改變植物葉片的Fv/Fm［26-27］。本研究結果表明，食用黑粉菌侵染后，茭白葉片的Fv/Fm并未發(fā)生明顯改變(P＞0．05)(圖4)，因此食用黑粉菌侵染對茭白來說并未形成生物脅迫，植株沒有產生類似病害的脅迫反應。據(jù)此，食用黑粉菌-茭白的互作體系并不是病原菌-植物的致病關系，而是類似于內生真菌與植物的互作關系，是植物-真菌交叉適應的結果［46］。

ΦPSⅡ是PSⅡ反應中心部分關閉時的光化學效率，其值大小可以反映PSⅡ反應中心的開放程度［9-10］。病原菌侵染植物往往導致葉片 ΦPSⅡ下降，進而降低植物葉片的光化學效率［11-13］。有研究發(fā)現(xiàn)，核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)侵染黃瓜后，抑制了CAT的活性，導致ROS的積累，直接傷害了光合機構PSI和PSⅡ的功能。對PSI的傷害抑制了PSⅡ電子向PSI的傳遞，進一步加劇了PSⅡ的傷害程度，導致更多過剩激發(fā)能的發(fā)生［47］。然而，本研究結果表明，食用黑粉菌侵染后，茭白葉片的ΦPSⅡ、ETR有所上升(P ＞0．05)(圖4)，這會導致PSⅡ有效光量子產量的增加，進而促進光合電子傳遞效率，增加ATP和NADPH的形成，最終導致光合速率的提高［28］。此外，食用黑粉菌侵染后，茭白葉片的非光化學猝滅(NPQ)略有下降(P ＞0．05)(圖4)，即過剩激發(fā)能降低，這反映了PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學反應的量增加［9-10］，即ΦPSⅡ和ETR升高(圖4)。另外，食用黑粉菌侵染導致的電子傳遞速率(ETR)的升高可能導致Rubisco活性的升高，最終促進光合速率增加［28，48］。

在長期的自然進化過程中，植物不斷遭受外來有害微生物的侵襲，威脅自身生長發(fā)育;另一方面，植物又不斷地與有益微生物形成互利共生關系，提高自身對外來脅迫的抵抗能力。研究結果表明，食用黑粉菌-茭白形成的互作體系，沒有出現(xiàn)一般病原菌侵染造成植物葉片PSⅡ破壞和膜質過氧化加重的現(xiàn)象，因此不屬于典型的病原菌和植物的致病關系。同時，食用黑粉菌侵染對茭白生長是不利的，表現(xiàn)為茭白的株高、葉長、葉寬、葉片厚度、根長、根重量、地上部重量等指標降低，這也不同于共生真菌對植物生長的促進作用。可見，食用黑粉菌與茭白之間的互作是介于植物病害與互利共生之間的一種互作關系［49-50］。

4 結論

食用黑粉菌侵染抑制了茭白的生長，表現(xiàn)為株高、葉長、葉寬、葉片厚度、根長、莖重量、根重量、地上部重量的降低，但卻顯著增加了植株的分蘗數(shù)。同時，食用黑粉菌侵染后，茭白植株較高的抗氧化酶活性(APX、CAT、POD、GR和SOD)可以更好地清除植株體內的活性氧(ROS)，引起含量和膜質過氧化程度(MDA含量)降低。侵染植株中H2O2的升高可能與可以在SOD的作用下轉化成H2O2和O2有關。作為一種內生真菌，食用黑粉菌侵染并未改變葉片PSⅡ最大光化學量子產量(Fv/Fm)，反而略微提高了葉片的PSⅡ實際光化學效率(ΦPSⅡ)、電子傳遞速率(ETR)，降低了葉片的非光化學猝滅(NPQ)。

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