二神散的氣質聯用分析及凝血活性研究

劉亞萍,陳佩東

(1.南京中醫藥大學附屬一院,江蘇南京210029;2.南京中醫藥大學,江蘇南京210046)

二神散方出自《普濟方》,組成為香附子一兩(燒存性),蒲黃一兩(炒),臨床可用于淋證的治療。淋證分為熱淋、血淋等6種證型[1]。淋證由于肝主藏血,肝郁化火,造成氣滯血瘀。香附、郁金等藥物使血不妄行、瘀血去而新血生[2],而蒲黃炭具有化瘀止血的功效[3]。香附中主要有單萜和倍半萜類化合物a-蒎烯、香附烯、香附酮等揮發性成分[4-5],而香附醋品和炭品中的化學成分含量發生變化[6-7]。蒲黃主要含有黃酮類成分,如香蒲新苷,異鼠李素、槲皮素、柚皮素等[8],蒲黃揮發油成分主要為烷烴類[9]。蒲黃具有止血、化瘀、通淋的功效,具有影響凝血活性[10]。本文通過氣質聯用法(GC/MS)對二神散中的化學成分進行分析,研究二神散的凝血作用。

1 儀器與試藥

Agilent 6890 GC-MS;LG-PABER血小板聚集凝血因子分析儀(北京世帝科學儀器公司)、離心機(上海安壽科學儀器廠),所用試劑均為分析純。

試劑盒:凝血酶原時間測定試劑盒(PT,批號:STG20101-46)、活化部分凝血活酶時間測定試劑盒(APTT,批號:ST20201-52)、凝血酶時間測定試劑盒(TT,批號:STG20301-35)、纖維蛋白原時間測定試劑盒(FIB,批號:STG20401-33),生產廠家均為北京世帝科學儀器公司。

蒲黃藥材采自內蒙古巴彥淖爾市五原縣境內,香附生品購于安徽銅陵(批號100326)經南京中醫藥大學吳啟南教授鑒定分別為香蒲科植物水燭香蒲的干燥花粉和莎草科植物莎草的干燥根莖。按2010版藥典炮制方法,蒲黃炒為黃褐色,香附炒成外表焦黑色。SD大鼠,雄性,體質量(200±20)g,購自浙江省實驗動物中心,許可證號:SCXK(浙)2008-0033。

2 方法與結果

2.1 GC/MS成分分析

2.1.1 色譜條件 色譜柱柱溫升溫程序:100℃保持1 min,以1℃/min升溫至180℃,保持1 min;繼續以6℃/min升溫至 220℃,保持 5 min。進樣口溫度220℃,檢測器(FID)溫度250℃。載氣:高純氦氣,流量1.0 mL/min,空氣400 mL/min,氫氣30 mL/min。分流進樣 ,分流比 50∶1,進樣量 1.0 μ L 。

2.1.2 質譜條件 EI離子流;電子能量70 eV;質量掃描100.0～550.0;四極桿溫度150℃;離子源230℃;離子倍增電壓1 500V;GC/MS接口溫度280℃。

2.1.3 樣品制備 取香附炭品和蒲黃炭品各50 g,加水800 mL,水蒸氣蒸餾提取,無水硫酸鈣吸水,取0.1mL揮發油提取物,置于1mL容量瓶,加入甲醇定容,濾過,即得。將制得的供試品采用自動進樣進行GC/MS檢測,導出數據。

2.1.4 分析結果 二神散的揮發油提取物經氣相色譜石英毛細管柱分離,質譜儀記錄質譜圖,得到GC/MS總離子流圖,見圖1。各色譜峰相應的質譜圖經計算機譜庫檢索確定其化學結構,并用峰面積歸一化法測定其相對含量,見表1。

2.2 凝血活性研究

2.2.1 樣品制備 參考臨床用量,二神散(蒲黃炭∶香附炭=1∶1)50 g以15倍量水煎煮提取2次,合并濾液并濃縮為1 g/mL。實驗前用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液將云南白藥、二神散水提濃縮液混勻并稀釋至所需濃度。

圖1 二神散總離子流圖

2.2.2 血瘀模型 取大鼠40只,雄性,體質量(200±20)g,隨機分為4組,分別為空白組、血瘀模型組、云南白藥組0.27 g/kg、復方組8.4g/kg,每組10只。正常組與模型組灌胃給藥0.5%羧甲基纖維素鈉溶液2 mL/100 g,其余組灌胃等體積的相應藥物,每日1次,連續7 d。第6天給藥后禁食,除空白組外,其余組背部皮下注射鹽酸腎上腺素1 mL/kg,共2次,中間間隔4 h,并在第一次注射4 h后將大鼠浸入0～2℃冰水冰浴5 min,復制急性血瘀大鼠模型,正常組注射等體積的生理鹽水。次晨各組給藥40 min后頸總動脈插管取血放入事先裝有枸櫞酸鈉溶液(3.8%)的試管中。

表1 二神散GC/MS圖譜中的主要化學成分

將所取血液以3 000 r/min離心10 min分離血漿,并按試劑盒的要求及操作步驟測定各組血漿凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)和纖維蛋白原時間(FIB),結果見表2,表3。

表2 二神散對凝血酶原時間(PT)、凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)和纖維蛋白原時間(FIB)的影響( x±s,n=10)

3 討論

經GC/MS檢測二神散揮發油提取物共分析出62個化合物,其中18個成分含量超過1%。香附具有疏肝理氣、調經止痛的作用[11],而香附炭主要用于婦女崩漏不止,表現出生行熟止的功效差別,香附炒炭后主要成分香附酮含量劇烈下降[6],本實驗中香附酮含量下降明顯。

表3 PT、APTT、TT的抑制率( x±s,n=10) %

淋證常有氣滯血瘀的癥狀,所以本實驗采用了血瘀型大鼠模型,實驗結果表明,二神散組能顯著縮短血瘀模型大鼠凝血酶原酶形成階段外源性途徑,顯著縮短血瘀模型大鼠凝血時間,能作用于纖維蛋白形成階段而顯著降低血瘀模型大鼠纖維蛋白原含量,說明二神散能通過促進凝血而表現出止血作用。

[2]周菲菲,付萍.經方治療淋證一得[J].實用中醫藥雜志,2010,26(2):112-113.

[3]馬長振,陳佩東,張麗,等.蒲黃炭對大鼠凝血系統影響的實驗研究[J].南京中醫藥大學學報,2010,26(1):42-43.

[4]Mesmin Mekem Sonwa,Wilfried A.Konig,Chemical study of the essential oil of Cyperus rotundus[J].Phytochemistry,2001,58(5):799-810.

[5]C.U.Tam,F.Q.Yang,Q.W.Zhang,et al.J.Guan,S.P.Li,Optimization and comparison of three methods for extraction of volatile compoundsfrom Cyperus rotundus evaluated by gas chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis,2007,44(2):444-449.

[6]陳勝璜,蔣孟良,袁干軍,等.香附不同炮制品中香附酮的含量測定[J].中成藥,1999,21(7):349-350.

[7]李英霞,侯立靜,劉青,等.不同地區市售香附飲片中α-香附酮含量測定[J].中國中醫藥信息雜志,2011,18(1):59-60.

[8]孔祥鵬,陳佩東,張麗,等.蒲黃的化學成分研究[J].吉林中醫藥,2011,31(1):66-68.

[9]吳練中.蒲黃揮發油化學成分研究[J].中草藥,1993,24(8):412.

[10]Liu L,Ma HY,Yang NY,et al.A Series of Natural Flavonoids as Thrombin Inhibitors:Structure-activity relationships[J].Thrombosis Research,2010,126(5):365-378.

[11]孟鳳云,金季玲.溫經理氣化瘀法治療原發性痛經28例[J].吉林中醫藥,2009,29(1):36-37.