通天草提取物對擬阿爾茨海默氏病模型大鼠學習記憶能力及其海馬區組織相關蛋白表達的影響

魏鐵花,李寶龍,劉 旭,賈博宇,周忠光＊,尹麗穎

(1.深圳市光明新區人民醫院康復科,廣州深圳518000;2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院,黑龍江哈爾濱150000)

阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)是老年癡呆最常見的一種類型[1-2]。AD是一種多因素相關的復雜性疾病,針對單靶點或單致病途徑的藥物療效欠佳。對于針對多靶點、多途徑治療,中藥提取物有其獨特的優勢,有望在AD的藥物干預領域實現新的突破。通天草(waternut Herb,herba eleocharitis)是莎草科植物荸薺(eleocharis dulci)的干燥地上莖,性輕清上逸,可引諸藥入腦,具有補腦、改善腦部血液循環、剔除腦絡瘀血的作用,常被用作治療心腦血管疾病的引經藥[3]。通天草醇提物和水提物對老年癡呆大鼠腦氧化性損傷具有保護作用,是近年中藥用于治療AD的重點研究藥物之一[4]。本研究旨在探討通天草提取物對擬AD模型大鼠學習記憶能力的影響,以及腦組織的病理學變化,試圖闡明通天草提取物抗AD的作用及其機制。

1 材料

1.1 藥品與試劑 兔抗 NF-κ Bp65、Iκ B-α、GFAP 、S100β多克隆抗體(北京博奧森生物工程有限公司);標準品Aβ1-40(購自Sigma公司),無菌生理鹽水配制成5 g/L,密封37℃恒溫箱培養1周,之后-20℃冰箱中保存備用。其它試劑均為分析純。

1.2 儀器 Morris水迷宮(中國醫學科學院藥物研究所);微量移液器(美國THERMO公司);生物顯微鏡(德國Leica公司);ChampGel-3200數字成像儀(北京賽智科技有限公司);SN-2大鼠腦立體定位儀(日本)。

1.3 動物及分組 Wistar大鼠96只,雄性,體質量220～250 g,購自黑龍江中醫藥大學實驗動物中心。隨機均分為8組:①陰性對照組、②假手術組、③AD模型組、④西藥治療組、⑤醇低組、⑥醇高組、⑦水低組、⑧水高組。在屏障動物實驗設施內正常飼養,給予充足飲水,自由攝食,自然光照。

2 方法

2.1 Aβ1-40海馬微量注射模型組 Aβ1-40海馬內注射制造老年性癡呆動物模型是一種公認的方法[5]。選擇大鼠右側海馬為注射靶區,經10%水合氯醛腹腔麻醉后,在前囟后3.5 mm,中線向左旁開2 mm處確定注射點。用微量注射器向腦組織內緩慢注射Aβ1-40溶液 2 μ L(10 μ g),牙科泥封住顱骨孔,術區用消炎粉消炎,縫合皮膚并消毒。假手術組選擇大鼠右側海馬注入等量生理鹽水,其它過程同上。陰性對照組不作任何處理。單籠飼養至大鼠完全清醒。

2.2 通天草提取物灌胃 將造模成功大鼠隨機分為AD模型對照組、西藥治療組、通天草水提物高劑量組、通天草水提物低劑量組、通天草醇提物高劑量組和通天草醇提物低劑量組,另設陰性對照組、假手術組,每組各12只。陰性對照組、假手術組和AD模型對照組:灌胃等體積生理鹽水。各組大鼠在造模后第7 d開始灌胃給藥,每日1次,連續21 d。

2.3 行為學觀察 現在檢測大鼠記憶力的Morris水迷宮的指標有很多,其中最常用的評價指標是定位航行實驗的“逃避潛伏期”[6]。在水池內裝入純凈自來水,加適量黑色素隱蔽站臺。實驗時將水池均分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個象限區,在第Ⅲ象限中放置1個沒于水下1 cm的站臺(站臺的區域為E區)。前6 d,每天每只大鼠從4個象限各自固定入水點入水進行訓練1次,記錄60 s內大鼠從入水到爬上平臺所需時間,即逃避潛伏期,共6 d。第7天,撤去站臺,進行空間探索試驗,將大鼠從第Ⅰ象限入水點放人水池,記錄120 s內大鼠在池中游泳路徑及在E區游泳穿越次數,作為評價大鼠學習成績的指標。

2.4 標本制備 水迷宮試驗結束后2 d,每組大鼠取6只,經心臟灌注0.9%生理鹽水250 mL,然后用4%多聚甲醛200 mL緩慢灌注,至動物尸體展開,肢體變硬為止。開顱快速取出完整大腦,固定于上述灌注液中,4℃冰箱保存,用于病理學和免疫組化檢測。

2.5 免疫組織化學檢測 1)腦組織固定、脫水、透明、包埋及切片,常規脫蠟到水;2)用3%H2O2室溫孵育10 min,再用PBS沖洗5 min,重復3次,以阻斷內源性過氧化物酶;3)熱修復抗原:將切片浸入枸椽酸鹽緩沖液(TBS,pH6.0)中,放于微波爐高火加熱至沸騰5 min后,保溫10 min,再加熱5 min,最后自然冷卻至室溫,PBS沖洗3次,每次5 min;4)加入一抗(NF-κ Bp65 1∶50;Iκ B-α 1∶50;GFAP 1∶100;S100β 1∶80),4 ℃冰箱里放置過夜,用PBS緩沖液替代特異的一抗雜交液為陰性對照。PBS沖洗3次,每次5 min;5)加入二抗:向載玻片上滴加二抗,37℃恒溫箱孵育30 min。PBS洗滌5 min×3次;6)DAB溶液顯色:向載玻片中滴加DAB顯色劑,室溫顯色,鏡下控制反應時間約5～30 min;7)復染及封片:蘇木素中復染1 min,清水沖洗返藍,然后用梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片后觀察。

2.6 結果分析 采用Motic 3000顯微攝影系統于400倍下拍照,每組隨機選取8張切片,每張切片在海馬CA1-CA3區隨機攝取3個完全不重疊的視野,采用Motic image advanced 3.2病理圖像分析軟件進行組化分析,并計數陽性細胞數。陽性表達為淡黃色或棕黃色。

2.7 統計學處理 統計結果以( x±s)表示。應用SPSS 13.0統計分析軟件包,先進行單因素方差分析,多組之間比較采用SNK-Q檢驗,進行相關性分析。P<0.05視為具有統計學意義。

3 結果

3.1 通天草提取物對AD大鼠學習記憶能力的影響結果見表1。

表1 通天草提取物對AD大鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數的影響(n=10, x±s)

3.2 通天草提取物對AD大鼠海馬區組織相關蛋白 表達的影響 結果見表2。

表2 各組大鼠海馬區相關蛋白表達(n=8, x±s)

4 討論

Morris水迷宮試驗是目前判斷動物空間學習記憶能力的重要試驗方法,該方法規避了跳臺法和避暗法造成動物防御性反射逼迫學習的缺點,減少了動物因驚恐心理而對實驗結果的影響。[7]

本研究根據β-淀粉樣蛋白級聯假說[8],建立Aβ1-40所致AD大鼠模型,利用Morris水迷宮實驗,結果發現通天草提取物能明顯改善Aβ1-40所致AD模型大鼠學習記憶障礙。利用免疫組織化學對腦組織切片中的β-淀粉樣蛋白(Aβ),進行原位定性、定位或定量研究,系統地探討了通天草提取物對Aβ1-40所致AD模型大鼠治療作用及可能機制。結果發現通天草提取物可顯著降低AD模型大鼠Aβ表達,改善Aβ沉積所造成的神經元病理形態學損害,減輕腦中炎性反應,同時通天草提取物能調節海馬區神經元中NF-κ B/Iκ B蛋白表達和抑制海馬區星形膠質細胞中GFAP和S100β蛋白過度表達。

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[3]劉旭,周忠光,安柏松,等.荸薺藥理學研究進展[J].中醫藥信息,2010,27(6):106-108.

[4]李寶龍,單毓娟,劉旭,等.通天草提取物對阿爾茨海默病大鼠腦氧化性損傷的保護作用[J].中醫藥信息,2012,29(4):24-27.

[5]鐘華,楊傲然,范吉平.中醫藥抗氧化損傷防治阿爾茨海默病[J].長春中醫藥大學學報,2007,23(5):99-100.

[6]羅小泉,駱利平,陳海芳,等.Morris水迷宮檢測大鼠記憶力方法的探討[J].時珍國醫國藥,2010,21(10):2667-2669.

[7]李玲,潘惠娟.康復訓練對雙側海馬梗死大鼠學習記憶功能的影響[J].第四軍醫大學學報,2004,25(22):2101-2104.

[8]付劍亮,邵福源.阿爾茨海默病發病機制研究進展[J].世界臨床藥物,2010,31(007),390-394.