β-catenin及C-myc在膽總管囊腫中的表達及其意義

黃順根，郭萬亮，汪健

（蘇州大學附屬兒童醫院外科，江蘇蘇州，215003）

先天性膽總管囊腫（congenital choledochal cyst，CCC）是一種少見的膽道系統囊性或梭形擴張畸形，目前確切的發病原因尚未完全明了，通常導致膽囊炎、膽管炎、膽結石等并發癥，隨著病變的進展甚至發生膽道的惡性轉化。Wnt信號通路在胚胎發育和腫瘤發生中起著重要的作用，β-catenin是Wnt經典途徑信號傳導過程中的重要成分，C-myc是βcatenin下游的靶基因。β-catenin及C-myc在細胞的增殖和分化的調控過程中起著重要的作用［1，2］，但有關其在人膽總管囊腫發生和發展方面的作用了解較少，尤其是在成人與兒童患者中表達是否有所差別國內尚無相關報道。為此，我們采用免疫組化技術及Western blot法，檢測Wnt/β-catenin信號通路中關鍵分子β-catenin及其下游靶基因C-myc在人膽總管囊腫中的表達情況，為進一步了解膽總管囊腫的演變提供依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集了2007年01月至2011年12月5年間在蘇州大學附屬兒童醫院兒童膽總管囊腫石蠟切塊和新鮮組織12例（兒童組）、蘇州大學附屬第二醫院確診并接受治療的成人膽總管囊腫石蠟切塊12例（成人組），同時收集我院足月新生兒死亡病例膽總管標本12例為對照（對照組，均排除胰膽管疾病），免疫組化染色檢測β-catenin和C-myc的表達情況，采用Western blot法，觀察C-myc蛋白在兒童組中表達情況。

1.2 試劑與儀器

主要試劑 β-catenin抗體（1∶100）、C-myc抗體（1∶300）均購自美國Prosci公司。實驗所需實驗儀器由蘇州大學兒科醫學研究所提供。圖像分析系統采用美國Media Cybernetics公司Imagepro-Plus（IPP）6.0專業圖像分析軟件。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化檢測：β-catenin、C-myc免疫組化采用SP法進行染色，抗原修復采用煮沸熱修復法，陽性對照由Prosci公司提供的陽性對照片，染色后均為陽性；以PBS液代替一抗作陰性對照，結果均為陰性。采用IPP 6.0圖像分析軟件定量分析免疫組化染色情況：400倍視野下每張切片選擇5～8個視野進行拍片，后保存于計算機進行專業圖像分析。圖像分析選擇的指標參照Mady等［3］方法，主要觀察陽性染色得分（mean calculate a quick score，MQS），即陽性染色比例與平均光密度乘積。每個切片經過圖像分析后，所得數值取平均值后即為該患者的分析指標值。

1.3.2 Western blot法檢測 C-myc蛋白表達：（1）膽總管平滑肌總蛋白提??；（2）BCA法繪制蛋白標準曲線并測量樣品蛋白濃度；（3）十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrohoresis，SDS-PAGE）變性電泳；（4）Western blot印跡；（5）轉印膜的免疫檢測：加入一抗工作液（C-myc單克隆抗體1∶300），室溫水平搖床孵育1 min；TBST室溫洗膜5 min×3次；加入二抗工作液（PBS稀釋至 1∶1 000），室溫水平搖床孵育 1 min，TBST 室溫洗膜5 min×3次；在膜表面加入新鮮配制的ECL化學發光孵育液，室溫孵育5 min；轉移至X線暗盒中曝光30 s，顯影5 min，定影5 min；根據結果調節曝光時間，再次曝光顯影；（6）結果分析：膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。以GAPDH的光密度（optical density，OD）值為參照。目的蛋白相對表達量計算方法：目的蛋白相對表達量=OD目的條帶/OD內參。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 β-catenin的表達及其圖像分析結果

在成人膽總管囊腫、兒童膽總管囊腫中，βcatenin表達呈棕褐色，染色強表達，在柱狀上皮呈細胞膜表達伴有部分細胞質和細胞核表達，在神經叢細胞呈細胞膜和細胞質表達，而間質細胞可見細胞核表達；對照組膽總管中，表達強度中等（圖1）。成人膽總管囊腫、兒童膽總管囊腫、以及對照組膽總管中β-catenin表達分別為1 401.514 8±267.240 6、1 653.664 4±565.094 2、990.706 7±447.731 3，3 組比較有統計學差異（P=0.018 1）。3組數據兩兩比較顯示：成人組與兒童組比較無統計學差異（P=0.355 6）；兒童組、成人組與對照組比較具有統計學差異（P分別為 0.007 9、0.028 2）。

2.2 各組C-myc表達的比較

在不同組別中，C-myc均存在陽性表達，主要表達于細胞核，呈中等程度表達，細胞膜、細胞質呈弱陽性表達（圖2）。成人組、兒童組以及對照組膽總管中C-myc表達分別為800.837 6±378.740 6、1 822.167 3±1 301.414 4、933.537 3±494.420 7。3 組間比較有統計學差異（P=0.039 3）。兩兩比較結果顯示：成人組與兒童組比較具有統計學差異（P=0.020 9）；兒童組與對照組比較具有統計學差異（P=0.030 3）；成人組與對照組比較無統計學差異（P=0.603 3）。

2.3 C-myc的Western blot檢測結果

結果顯示，兒童組和對照組C-myc蛋白表達量分別為 1.007 0±0.662 9、0.426 3±0.102 1，經秩和檢驗比較，兩組間具有統計學差異（Z=-2.408 7，P=0.016 0，圖3）。

圖1 各組β-catenin表達比較×400Fig.1 β-catenin expression in the groups×400

圖2 各組cmyc表達情況比較400Fig.2 c-myc expression in three groups×400

圖3 兒童CCC組與對照組Westernblot結果比較Fig.3 Comparison of Western blot results of C-myc between thechildren group and the control group

3 討論

膽總管囊腫是一種少見的膽道系統的囊性或梭形擴張畸形。有關該疾病的病因學說很多，其中最為廣泛接受的說法是胰膽管合流異常（pancreaticobiliary maljunction，PBM），該學說認為膽總管與胰管匯合于十二指腸外，且共同管過長［4］，而生理情況下胰管內的壓力較膽總管為高，因此導致胰液返流入膽總管，產生炎性反應并造成膽總管壁破壞進而發生擴張［5］。有研究顯示β-catenin和C-myc在發育、基因調節以及腫瘤的發生中發揮重要的作用，但在CCC患者中有關β-catenin和C-myc表達及其分子機制國內尚未見報道。由于膽總管囊腫的形成可能也存在膽道上皮的異常增殖，研究β-catenin和C-myc在膽總管囊腫中的表達，有助于了解膽總管囊腫惡性轉化過程中的相關機制。

β-catenin在不同年齡膽總管囊腫中的表達及其意義為β-catenin是原癌基因編碼的蛋白質，人類β-catenin的基因定位于染色體3q21，主要存在于細胞質中，細胞質中未被激活的β-catenin被磷酸化而啟動泛素系統，進而經蛋白酶體途徑降解［6］。β-catenin有兩種主要的功能，一是作為細胞間的黏附分子維持上皮細胞間的黏附；另外一種重要的功能是βcatenin作為Wnt信號通路的一部份，參與基因表達的調節［1］。當 Wnt與其受體 Frizzled 蛋白（Fz）結合時，可以抑制蛋白激酶GSK-3的活性。而GSK-3和Axin以及APC組成的復體可以使β-catenin產生磷酸化，促進其自身的降解，在GSK-3的活性受到抑制的情況下，可以使β-catenin在細胞質內積聚，從而使之可以進入細胞核與TCF和LEF結合以調節基因的表達［7］。

本研究采用免疫組化檢測不同標本膽總管囊腫β-catenin的表達情況，在表達強度方面，可見成人膽總管囊腫和兒童膽總管囊腫中β-catenin的表達呈強表達，而在對照組中，表達強度相對較弱。免疫組織化學圖像分析顯示成人膽總管囊腫、兒童膽總管囊腫中的β-catenin表達與對照組比較，均具有統計學差異，而成人膽總管囊腫和兒童膽總管囊腫兩者之間β-catenin表達無統計學差異，實驗結果提示β-catenin在膽總管囊腫進展中發揮一定作用。Kimura等［8］報道1組膽道腫瘤患者，研究結果顯示β-catenin蛋白的亞細胞定位與腫瘤的大小、患者的年齡、PBM合并與否無顯著性差異，然而β-catenin的亞細胞定位在所有患者中具有顯著性差異，亞細胞定位依賴于腫瘤的分級，其研究結果提示膽囊癌發生過程中，β-catenin可能通過Wnt經典信號途徑起一定的作用。在本研究中，無論是成人膽總管囊腫還是兒童膽總管囊腫，其β-catenin的表達均高于對照組。膽總管囊腫患者發生癌變的高風險，可能提示β-catenin的過表達在膽總管囊腫癌變發生與發展中起到重要的作用。但本組中兒童患者βcatenin表達較成人組更高，提示兒童膽總管囊腫上皮破壞嚴重，惡性轉化潛能更高，可能由于胰膽管返流更加嚴重所致。因此有必要早期采取手術治療，以防膽道惡性轉化。

C-myc是β-catenin下游的靶基因，在細胞的惡性轉化中發揮著重要的作用［9］。本實驗發現所有組均存在C-myc陽性表達，主要表達于細胞質和細胞核，呈中等程度表達。兒童膽總管囊腫組C-myc表達較成人組與對照組明顯增高（P＆lt;0.05），可能是因為兒童膽總管囊腫患者合并胰膽管合流異常、胰膽管返流嚴重所致，提示C-myc可能在兒童膽總管囊腫的演變中具有一定的意義。成人膽總管囊腫患者以膽管炎和胰腺炎的表現居多，而兒童膽總管囊腫中，以黃疸和腹部腫塊更為常見［10］，提示兒童患者囊腫內壓力及膽道受阻情況比成人更加嚴重，這可能也是造成兒童膽總管囊腫壁纖維化較成人更加嚴重的原因之一，膽汁排出受阻更為嚴重，膽道上皮破壞更為嚴重，可能是導致C-myc表達較高的原因之一。成人膽總管囊腫C-myc表達和對照組相當，可能與兩者都處在一個較高的表達水平上有關。同時因為標本來源限制，本試驗無法確定正常成人膽總管C-myc的表達水平，因此出現成人膽總管囊腫與對照組（足月新生兒）膽總管C-myc表達無差異的結果。本實驗同時也證實了兒童膽總管囊腫C-myc表達較對照組顯著增高。這一結果也進一步提示了C-myc在膽總管囊腫進展中扮演了重要角色。有學者認為［11，12］C-myc在腫瘤的發生中起到重要的作用，該基因的易位重排及擴增是很多腫瘤產生的原因。本研究中可見兒童膽總管囊腫患者明顯存在C-myc的高表達，結合前述β-catenin表達同時增高，這種高表達提示Wnt經典信號途徑在兒童膽總管囊腫的進展中可能發揮一定作用，由此推測其可能是膽總管囊腫的癌變可能機制之一。

綜上所述，本研究結果提示β-catenin在兒童和成人膽總管囊腫患者中表達明顯增高，β-catenin可能在膽總管囊腫惡性轉化中起一定作用，而C-myc在兒童膽總管囊腫表達較成人組顯著增高，提示經典Wnt信號途徑可能在兒童膽總管囊腫的進展和惡性轉化過程起到一定作用。

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