犬肝射頻消融后移行區PET/CT表現與血管內皮細胞生長因子表達的相關性

杜小麗，暢智慧，王傳卓，劉兆玉，崔鵬

（中國醫科大學附屬盛京醫院放射科，沈陽 110004）

近年來，射頻消融（radiofrequency ablation， RFA）迅速發展，逐漸成為臨床上有效治療肝臟惡性腫瘤的一項非外科手術療法［1］，尤其是小肝癌［2］。但RFA術后腫瘤的殘留和復發率相對較高［3］，在治療肝臟腫瘤時，RFA治療安全區域應超過腫瘤邊緣1.0 cm，以提高腫瘤滅活率［4］。因此，腫瘤周邊（移行區）的正常肝組織也會受到熱損傷。已有大量關于影像學評價RFA治療肝臟腫瘤療效的報道，其中PET/CT集形態學及功能學于一體而優勢明顯，但熱損傷的肝組織與殘余腫瘤在18F FDG-PET/CT上均可出現高代謝，導致鑒別困難［5～7］。組織損傷后會有一個修復過程，其中不僅有多種修復細胞參與，還有許多生長因子在這一過程中發揮重要作用。目前認為，血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）通過影響與其相應的血管內皮上的受體來促進血管通透性的增加和血管的增生，促進肉芽組織的形成，在介導內皮細胞遷移及組織修復中起重要作用［2，8，9］。深入研究移行區肝組織在修復過程中的代謝機制，將有助于與殘余腫瘤鑒別。本實驗通過觀察犬肝組織RFA術后移行區PET/CT表現及VEGF的表達情況，探討移行區肝組織PET/CT表現特點及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗設備和材料

消融設備為北京為爾福電子公司生產的WE-7568多極射頻腫瘤消融儀和WHK-8型多極針消融電極（由母針1枚、子針10枚構成，子針完全展開成扁球型，最大直徑5 cm）。CT與PET/CT掃描均使用GE公司生產的Discovery ST-16 PET/CT一體機，PET掃描示蹤劑由GE Mini-Tracer回旋加速器生產（示蹤劑為18F-FDG，放射性純度＞95%），圖像分析在Xeleris工作站上完成。

1.2 實驗動物及分組

本實驗符合動物實驗倫理學，已通過中國醫科大學倫理委員會的批準。選成年健康雜種犬15只，雌雄不拘，體質量15～20 kg，所有實驗犬均由中國醫科大學附屬盛京醫院動物部提供。每次行RFA及影像檢查前，實驗犬禁飲食12 h；PET/CT檢查前監測血糖，確保實驗犬在行PET/CT檢查時的血糖值在正常范圍內（血糖過高或過低可能會影響肝臟對18F-FDG的攝?。?。實驗全程使用聯合麻醉，速眠新（鹽酸二氫埃脫啡、氟哌啶醇、保定寧合劑）0.1～0.15 mL/kg肌肉注射行全身麻醉，戊巴比妥鈉10 mg/kg增加麻醉效果。術中根據情況追加速眠新，劑量為首次劑量的1/3～1/2。

按隨機數字表法將15只犬分成5組，每組3只，對每只犬肝臟行2次RFA治療，共得到30個消融灶。根據RFA術后行影像檢查時間的不同，將實驗組命名為即刻組、1周組、2周組、4周組和8周組。即刻組：RFA治療后2 h內行PET/CT掃描，完成檢查后將犬處死，取肝臟病理；1周組：RFA治療后，將犬送回動物部常規飼養，1周后行PET/CT掃描，完成檢查后將犬處死、取病理；依此類推，2周組、4周組和8周組分別是RFA治療后將犬飼養2周、4周和8周再行PET/CT掃描，完成檢查后將犬處死、取病理。

1.3 RFA

每次RFA均在CT引導下實施，將犬的雙前肢及肝區備皮，仰臥，外電極固定于雙前肢。肝區鋪定位紙，CT平掃定位后選擇合適的體表穿刺點（有意選擇遠離肝包膜、肝門區及大血管分支的肝實質），常規碘伏消毒，將射頻電極分別穿刺入肝左、右葉，展開電極子針，直徑2 cm，進行RFA治療。設定射頻發生器治療溫度90℃，脈沖頻率290 kHz，每個治療區消融10 min，消融過程中功率逐漸上升，最大輸出功率為200 W。術后連續3 d肌肉注射青霉素抗炎（80萬U/d）。

1.4 PET/CT掃描

以5 Mbq/kg的劑量沿預先安置的套管針注射18F-FDG，注藥后將犬安放在安靜、避光的房間，60 min后開始采集圖像。PET采用3D掃描模式，采集1個床位，時間3 min。圖像經衰減校正，采用有序子集最大期望值法進行重建。

1.5 PET/CT圖像分析

PET/CT影像由1名放射科醫師與1名核醫學科醫師進行評估。整個過程采用盲法（醫生各自閱片，互不交流），分析各組犬肝臟的PET/CT表現并測量30個消融灶移行區的標準攝取值（standardized uptake value，SUV），每個指標測量3次，結果取平均值。具體方法：選取消融灶最大截面及其上、下臨近層面，在每個層面的移行區勾畫3個直徑2～4 mm的小圓形興趣區（region of interest，ROI），避開大血管，盡量避開消融灶中心壞死區及周圍正常肝組織，測量其SUV。

1.6 組織病理學檢查

每組實驗犬完成規定的影像檢查后被處死（沿預先安置在股靜脈的套管針注射10%氯化鉀溶液30 mL，使其心臟停跳而死亡），剖腹取治療后的肝臟組織進行病理檢查。橫斷切開凝固壞死灶及與之相鄰的正常肝組織，行HE染色。取移行區肝組織行ELISA法測定VEGF含量。

1.7 測定VEGF含量

采用雙抗體夾心ELISA法測定肝組織VEGF含量。以抗大鼠VEGF單抗包被于酶標板上，移行區肝組織勻漿上清液中的VEGF與單抗結合，加入生物素化的抗鼠VEGF，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入酶底物鄰苯二胺，出現黃色，加稀硫酸終止反應。在492 nm處測吸光度（A）值，VEGF濃度與A值成正比，通過標準曲線求出標本中VEGF濃度（陽性對照為標準品，陰性對照采用無VEGF的標準品）。

1.8 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件，采用Pearson相關分析，P＆lt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RFA結果

15只實驗犬均成功行RFA手術，術后犬恢復良好，無手術并發癥。本研究對15只犬的30個消融灶進行評估與分析。

2.2 各組PET/CT與病理表現

即刻組、1周組、2周組及8周組消融灶PET/CT圖像（圖1）均表現為18F-FDG低代謝，1周組、2周組消融灶周圍可見環形FDG高代謝區，由內向外依次為低－高－等代謝（圖1B、1C）；4周組 PET/CT表現與1周組相似。即刻組病理表現：3層帶狀結構，中央區為早期凝固壞死的肝組織，呈嗜酸性染色，肝細胞分解，小葉及肝索結構破壞；中間移行帶表現為肝竇擴張、充血，殘留的肝細胞萎縮；外帶肝細胞反應較輕，可見水腫及空泡樣變性，細胞核多正常（圖2A）。2周組病理表現：凝固壞死的肝組織細胞核模糊，周圍可見肝竇局灶性擴張、充血，大量中性粒細胞、巨噬細胞浸潤，少量纖維組織形成（圖2B）。8周組病理表現：中央區為壞死的肝組織，外周纖維組織增生明顯，其內可見慢性炎性細胞浸潤（圖2C）。

圖1 各組犬肝臟RFA術后PET/CT表現Fig.1 The image of PET/CT after RFA in canine liver in all groups

圖2 各組犬肝臟RFA術后病理表現Fig.2 The pathology after RFA in canine liver in all groups

2.3 VEGF含量與SUV值相關性分析

每組移行區肝組織平均VEGF水平與平均SUV 值呈顯著相關（r=0.933，P＆lt;0.05），見圖3。

3 討論

隨著RFA技術的不斷發展，在臨床腫瘤治療等領域中也得到了廣泛的應用，RFA的原理是通過高溫產生熱損傷，使組織細胞發生凝固性壞死［7］。目前對RFA在臨床應用的療效報道較多，但對RFA術后正常組織修復過程的特點鮮有報道。正常肝組織會對RFA熱損傷產生一系列炎性反應，在PET/CT上多表現為壞死灶周圍組織的高代謝，而大部分惡性腫瘤亦有上述影像表現，因此這種炎性反應嚴重影響了腫瘤殘留或復發的準確判斷［10］。組織損傷后會有一個修復過程，其中不僅有多種修復細胞參與，還有許多生長因子在這一過程中發揮重要作用。目前認為，VEGF通過影響與其相應的血管內皮上的受體來促進血管通透性的增加和血管的增生，促進肉芽組織的形成，在介導內皮細胞遷移及組織修復中起重要作用［2，8，9］。鑒于此，研究肝組織 RFA 后移行區不同時間點VEGF表達，將有助于了解移行區組織修復的過程，并與PET/CT表現對照，為鑒別腫瘤殘留或復發提供理論依據。并且有研究結果表明，血清及肝組織中VEGF水平高，肝臟RFA術后預后較差［11］。

圖3 各組犬肝RFA術后移行區組織SUV值與VEGF表達的相關性分析Fig.3 The correlation analysis of SUV and VEGF expressionsafter RFA in canine liver in all groups

本研究結果表明，PET/CT可反映犬肝臟RFA術后不同時期病理變化，移行區VEGF的表達與SUV值變化具有一定的相關性。RFA術后超急性期（即刻組）消融灶中央的凝固壞死導致血液流出道受阻、肝竇擴張充血，PET/CT上未出現代謝變化，表現為等代謝，VEGF濃度與SUV值均接近正常肝組織。此后，炎性細胞的浸潤和肉芽組織的形成使組織代謝增高，PET表現高代謝，VEGF濃度與SUV值逐漸增高；隨著肉芽組織逐漸成熟，代謝程度也隨之減低，VEGF濃度與SUV值逐漸降低；肉芽組織被纖維組織代替后（8周組），代謝接近正常肝組織，VEGF濃度與SUV值也恢復到正常肝組織水平（圖1、2）。

本研究小組之前的研究證實肝臟惡性腫瘤患者RFA后早期復查PET/CT（24 h內）可避開炎性反應干擾、準確評價消融效果，但存在假陽性病例［6，8，10］，并主張肝臟腫瘤RFA治療后2 h內復查PET/CT，以便更早、更準確地判斷RFA效果。正常肝組織對射頻損傷產生的炎性反應一般持續4周左右，表現為消融灶周圍組織的高代謝，在這期間正常肝組織的炎性反應在PET/CT上的表現會對準確判斷是否存在腫瘤殘余造成干擾。術后4周，尤其到術后8周時，PET/CT受炎性反應的干擾均較小。對于術后8周影像復查，PET/CT掃描將不受炎性反應干擾。經本研究相關分析顯示，SUV值與VEGF的表達顯著相關（圖3），且 Veit等［12］研究顯示殘余灶平均SUV值為8.7（7.7～10.5），顯著高于移行區，監測肝臟腫瘤患者血漿VEGF濃度可能將有助于評價RFA治療效果，但腫瘤殘存組織PET/CT表現與VEGF的關系還有待進一步研究。隨著分子影像學的發展，已有關于VEGF及其受體顯像的研究報告，利用分子影像手段，通過監測VEGF表達來評價RFA治療肝臟腫瘤療效將是未來發展的趨勢。

從上述分析可以看出，犬正常肝組織RFA術后，熱損傷的肝組織經過一個有序的修復過程，VEGF在修復過程中有著重要的作用，并與PET/CT表現存在一定的相關性。本研究不足之處：（1）移行區較薄，對比測量其SUV值影響較大，并且無法排除部分容積效應的影響；（2）正常肝組織RFA術后的病理修復和PET/CT表現及VEGF的表達，還是有別于肝癌等病理組織RFA后的變化，在臨床工作中肝臟惡性腫瘤伴（或不伴）肝硬化背景下這些因素可能會對射頻效果產生影響，影像特點可能與正常肝組織消融有所不同，相應的病理變化也可能存在差異。為能更準確地判斷臨床腫瘤RFA治療后的變化，還有待對肝癌的RFA術后的變化做進一步的實驗研究。

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