維康醇對肝癌細胞增殖抑制和誘導凋亡的作用

王艷麗，朱曉琳，段麗麗，陳杰鵬，牛哲峰，曲迎春，叢培芳，李嶺，張美俠

（1.中國醫科大學藥學院臨床藥理教研室，沈陽 110001；2.廣東汕頭保稅區雙駿生物科技有限公司應用生物技術研究所，廣東 汕頭515071；3.四川大學生命科學學院遺傳醫學研究所，成都 610041）

肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發病率居全球惡性腫瘤的第6位，死亡率居第3位［1］，5年生存率＆lt;5%［2］。肝癌的治療手段不斷豐富，但目前其治療仍然以手術治療為主，配合以放療、化療、生物治療等多種治療手段。到目前為止，肝癌的化療效果還不盡如人意。紫杉烷類的代表藥物紫杉醇（pacli?taxel，PTX）是從紫杉樹樹皮中提取的一種天然植物類抗腫瘤藥物，是乳腺癌、卵巢癌及非小細胞肺癌的一線和二線治療藥物，并可用于治療頭頸癌、食管癌、精原細胞瘤和復發性非霍奇金淋巴瘤等［3～7］。維康醇是在PTX菌種發酵過程中獲得的產量較大的一種新型單體化合物。研究證實，維康醇對前列腺癌、胃癌、白血病等惡性腫瘤有抑制作用［8～10］。本研究組前期研究結果證實其對胰腺癌、卵巢癌等腫瘤細胞株也具有增殖抑制作用，并具有引起細胞周期阻滯和誘導細胞凋亡的作用，但它對肝癌細胞的作用未見報道。本研究擬應用MTT法、流式細胞術等方法，研究維康醇對肝癌細胞增殖抑制、細胞周期阻滯及細胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI?1640培養液（GIBCO公司，美國），胎牛血清（天津灝洋生物公司，中國），MTT（methylthiazolyl tetrazolium）、碘化丙錠（propidium lodide，PI）（Amres?co公司，美國），Annexin V?FITC試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司，中國）。人肝癌細胞系HepG2由中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所提供。維康醇由廣東省汕頭市雙駿生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞增殖：取對數生長期的HepG2細胞制成細胞懸液（5×104/mL），接種于96孔板中（100 μL/孔）。培養24 h后加入以含10%FBS的RPMI?1640培養液稀釋的藥物，終濃度分別為3、10、30 μmol/L，每個濃度設3個復孔，同時包括實驗組、溶劑對照組、空白對照組，藥物作用24、48、72 h后，加入MTT（5 mg/L），每孔10 μL，37 ℃孵育4 h，加入 100 μL 10%SDS（含 10 mmol/L HCl）以終止反應，37℃過夜后使用酶標儀檢測570 nm波長處的吸光度值（OD值）。實驗重復3次。計算細胞增殖抑制率=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.2 流式細胞術檢測細胞周期：HepG2細胞接種至6孔板內（1×106/孔），貼壁過夜，次日加入維康醇，濃度分別為3、10、30 μmol/L，同時設溶劑對照組。藥物作用48 h后，0.25%胰酶消化收集細胞，預冷的70%乙醇4℃固定細胞過夜。用100 mg/mL PI（含50 μg/mL RNA酶）溶液重懸細胞，室溫下避光染色15 min后，用流式細胞儀進行細胞周期檢測。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率：HepG2細胞接種于6孔板中（1×106/孔）過夜，分別用3、10、30 μmol/L維康醇及溶劑處理，48 h后收集細胞，預冷PBS離心洗滌2～3次。將細胞重懸于250 μL結合緩沖液中，加入10 μL Annnexin V?FITC和5 μL PI，輕輕混勻，室溫避光反應30 min后，用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.3 統計學分析

采用SPSS 16.0統計軟件處理，對數據進行單因素方差分析、LSD?t檢驗，以雙側P＆lt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 維康醇對HepG2細胞的增殖抑制作用

MTT實驗結果顯示：不同濃度（3、10、30 μmol/L）及作用時間（24、48、72 h）條件下，維康醇均對HepG2細胞的增殖具有抑制作用，且隨著藥物濃度的升高及作用時間的延長抑制率也相應增加，與對照組相比差異有統計學意義（P＆lt;0.05）。說明維康醇對HepG2細胞具有明顯增殖抑制作用，并呈時間和劑量依賴性。見圖1。

圖1 維康醇對HepG2細胞的增殖抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of alternol on the proliferation of HepG2 cells

2.2 流式細胞儀檢測維康醇對HepG2細胞周期的影響

流式細胞儀檢測結果顯示：30 μmol/L維康醇作用于HepG2細胞48 h后，處于G2/M期的細胞比例明顯升高［30 μmol/L維康醇處理組的G2/M期的細胞為（16.39±0.5）%，對照組的G2/M期的細胞為（9.4±1.59）%］，同時伴隨G1/G0期的細胞比例下降［30 μmol/L維康醇處理組為（60.23±2.1）%，對照組為（76.92±8.39）%］，差異有統計學意義（P＆lt;0.01）。見圖2。

2.3 流式細胞儀分析維康醇對HepG2細胞凋亡的誘導作用

Annexin V?FITC/PI染色檢測結果顯示：維康醇可以引起HepG2細胞凋亡，30 μmol/L維康醇作用于HepG2細胞48 h后的細胞凋亡率為（31.5±5.78）%，溶劑對照組為（6.98±2.43）%。見圖3。

3 討論

HCC的發病率占所有腫瘤疾病的5%，全世界每年約600 000人死于肝癌［2］。目前HCC仍以手術治療為主，但治療率低、復發性高、預后差。化學藥物治療是治療肝癌尤其是無手術指征的晚期肝癌的重要方法，但常因耐藥和復發導致肝癌化療失敗［11］。由于肝癌的不良預后，研究開發新的有效的抗肝癌新藥仍然是未來的研究熱點。

圖2 維康醇對HepG2細胞周期的影響Fig.2 Effect of alternol on cell?cycle distribution of HepG2 cells

圖3 維康醇對HepG2細胞凋亡的影響Fig.3 Effects of alternol on HepG2 cells apoptosis

惡性腫瘤的無限增殖特性與細胞增殖周期的失控有關［12］。正常的細胞周期由G1?S?G2?M組成，其間存在G1/S和G2/M 2個重要調控點，其調控功能的喪失導致腫瘤的發生。多數化療藥物均可引起細胞周期阻滯，達到抗腫瘤的作用。本研究結果顯示：維康醇引起肝癌HepG2細胞在G2/M期比例明顯增加，并伴隨G1/G0期的細胞比例下降，證實維康醇對肝癌HepG2細胞存在細胞周期阻滯現象。

研究證實，細胞周期與細胞凋亡既相互聯系，又相互獨立。細胞凋亡是指真核細胞為維持內環境穩定，由基因調控的細胞自主性有序性的死亡，它涉及一系列基因的激活、表達以及信號轉導途徑。細胞凋亡的發生通常是細胞先阻滯在細胞周期的某一時相，繼而在此期發生細胞凋亡，從而表明腫瘤的發生發展不僅是由于細胞增殖的失控，也與細胞凋亡受阻相關。因此抑制腫瘤細胞的增殖和誘導腫瘤細胞發生凋亡是大多數化療藥物抗腫瘤的主要作用機制［13～15］。本研究結果證實30 μmol/L維康醇作用于HepG2細胞可誘導其發生凋亡。

綜上所述，維康醇對肝癌HepG2細胞的增殖具有明顯抑制作用，且呈濃度、時間依賴性。維康醇作用于HepG2細胞后，引起G2/M期細胞周期阻滯，同時誘導細胞的凋亡。維康醇通過引起細胞周期阻滯和誘導細胞凋亡抑制了肝癌HepG2細胞的增殖，從而達到抗肝癌作用。但其具體的分子機制有待進一步研究。

［1］Poon D，Anderson BO，Chen LT，et al.Management of hepatocellu?lar carcinoma in Asia：consensus statement from the Asian Oncology Summit 2009［J］.Lancet Oncol，2009，10（11）：1111-1118.

［2］Said A，Wells J.Management of hepatocellular carcinoma［J］.Mi?nerva Med，2009，100（1）：51-68.

［3］Hong WS，Jeon JY，Kang SY，et al.Comparison of neoadjuvant adri?amycin and docetaxel versus adriamycin，cyclophosphamide fol?lowed by paclitaxel in patients with operable breast cancer［J］.J Korean Surg Soc，2013，85（1）：7-14.

［4］Wang P，Chen J，Mu LH，et al.Propofol inhibits invasion and en?hances paclitaxel?induced apoptosis in ovarian cancer cells through the suppression of the transcription factor slug［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013，17（13）：1722-1729.

［5］Sakakibara?Konishi J，Oizumi S，Kinoshita I，et al.Phase I study of concurrent real?time tumor?tracking thoracic radiation therapy with paclitaxel and carboplatin in locally advanced non?small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2011，74（2）：248-252.

［6］Bauman J，Langer C，Quon H，et al.Induction chemotherapy with ce?tuximab，carboplatin and paclitaxel for the treatment of locally ad?vanced squamous cell carcinoma of the head and neck［J］.Exp Ther Med，2013，5（4）：1247-1253.

［7］Gu M，Li SY，Huang XE，et al.A phase II study on continuous infu?sional paclitaxel and 5?FU as first?line chemotherapy for patients with advanced esophageal cancer［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2012，13（11）：5587-5591.

［8］Yeung ED，Morrison A，Plumeri D，et al.Alternol exerts prostate?se?lective antitumor effects through modulations of the AMPK signaling pathway［J］.Prostate，2012，72（2）：165-172.

［9］Liu X，Wang J，Sun B，et al.Cell growth inhibition，G2M cell cycle arrest，and apoptosis induced by the novel compound alternolin hu?man gastric carcinoma cell line MGC803［J］.Invest New Drugs，2007，25（6）：505-517.

［10］Liu ZZ，Zhu J，Sun B，et al.Alternol inhibits proliferation and in?duces apoptosis in mouse lymphocyte leukemia（L1210）cells［J］.Mol Cell Biochem，2007，306（1?2）：115-122.

［11］Iyer P，Zekri AR，Hung CW，et al.Concordance of DNA methyla?tion pattern in plasma and tumor DNA of Egyptian hepatocellular carcinoma patients［J］.Exp Mol Pathol，2010，88（1）：107-111.

［12］Jiang Y，Yang J，Yang C，et al.Vitamin K4 induces tumor cytotox?icity in human prostate carcinoma PC?3 cells via the mitochondria?related apoptotic pathway［J］.Pharmazie，2013，68（6）：442-448.

［13］Lee SK，Kim HN，Kang YR，et al.Obovatol inhibits colorectal can?cer growth by inhibiting tumor cell proliferation and inducing apop?tosis［J］.Bioorg Med Chem，2008，16（18）：8397-8402.

［14］范京惠，左玉柱，李一經.細胞凋亡的研究進展［J］.東北農業大學學報，2005，36（6）：804-807.

［15］季宇彬，高世勇，張秀娟.羊棲菜多糖誘導腫瘤細胞凋亡的研究［J］.中國中藥雜志，2004，29（3）：245-247.