丙型肝炎患者外周血單核細胞中IFNAR2 mRNA表達的研究

孫翠明，聞穎

（中國醫科大學附屬第一醫院傳染科，沈陽 110001）

在全世界范圍內約50%～80%的丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染者發展為慢性肝炎、肝硬化甚至肝細胞癌［1］。干擾素（interferon，IFN）或干擾素聯合利巴韋林是目前全世界公認的治療丙型肝炎的有效措施。與IFN療效有關的因素包括病毒因素（病毒載量、病毒基因型等）［2～4］及宿主因素（年齡、性別、種族、肝臟組織學等）［5］。IFN的活性與其受體的結合力有關。干擾素受體分為Ⅰ型及Ⅱ型，Ⅰ型受體是IFN?α及IFN?β的共用受體，分為IFN?α受體1（interferon alpha receptor 1，IFNAR1）和IFN?α/β受體 2（interferon alpha/beta receptor 2，IFNAR2）［6］。有研究表明，中國漢族人群中IFNAR2與IFN治療乙型肝炎的療效有關［7］；也有一些研究表明，在丙型病肝炎患者肝組織中，IFNAR的表達與IFN抗病毒療效有關［8］。

外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）是丙型肝炎病毒的主要感染部位，但有關外周血單核細胞中IFNAR表達的研究卻很少。Yamaguchi等［9］研究表明PBMC IFNAR2 mRNA的表達水平與其在肝組織中表達水平有關，但IFNAR1 mRNA在外周血單核細胞及肝組織中的表達卻無相關。本實驗研究在HCV不同感染階段PBMC IF?NAR2 mRNA的表達水平，并進一步探討PBMC IF?NAR2 mRNA水平與IFN抗病毒療效間的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象及分組

選取傳染病院肝病內科2005年11月至2006年12月間58例未接受過IFN治療，且HCV?RNA≥1.0×103拷貝/mL的丙型肝炎患者作為實驗組。診斷符合2000?09中華醫學會傳染病與寄生蟲分會、肝病學分會聯合修訂的病毒性肝炎防治方案［10］。其中54例患者丙肝抗體陽性時間＆gt;6個月（其中8名為肝硬化），4例患者丙肝抗體陽性時間＆lt;6個月。以下情況的患者不能入組：失代償期肝硬化；HBsAg陽性；合并HIV感染；中性粒細胞計數＆lt;1 500/mm3；血小板＆lt;80 000/mm3；血紅蛋白＆lt;110 g/L；血肌酐＆gt;1.5 mg/dL；嗜酒或有藥癮者；孕婦或哺乳期婦女。入組的患者均無其他肝臟疾病。所有患者均檢測血清谷丙轉氨酶（ALT）、丙肝抗體、PBMC IFNAR2 mRNA水平及肝臟超聲。

按照干擾素治療前后，將實驗分為2個階段。第一階段實驗中實驗組患者分為3組：急性肝炎組（4例）；慢性肝炎組（46例）；肝硬化組（8例；Child A級，肝功能基本正常，無肝功能失代償表現）。15名健康志愿者作為對照組，檢測其ALT水平、HCV?RNA載量。為了去除基因型的影響，在第二階段實驗中（IFN或IFN聯合利巴韋林治療階段：重組人干擾素α?2b 300 MU隔日皮下注射，利巴韋林1 000 mg/d口服）僅32例基因1型患者入組。所有實驗方案均經患者同意并經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 PBMC的提取：應用密度梯度離心法，從4 mL肝素抗凝外周血中提取單核細胞。用生理鹽水稀釋外周血至8 mL，分裝至2個EP管，各加入2 mL淋巴細胞分離液后以900 g離心。室溫孵育30 min后，外周血單核細胞便處于中間層。吸取中間層細胞，于離心管中稀釋至10 mL，離心2次，并在每次離心后室溫孵育10 min。移除上清后，將外周血單核細胞于-70℃保存。

1.2.2 IFNAR2 mRNA的擴增：用guanidineisothiocy?anate?phenol?chloroform法從外周血單核細胞中提取RNA。主要過程為：95℃預變性5 min，37℃逆轉錄30 min，94 ℃變性35 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環，72℃末延伸7 min。GAPDH mRNA作為內參。IFNAR2 mRNA的擴增引物為：上游引物5′?GCTTTTGAGCCAGAATGCCT?3′；下游引物 5′?CCCTCTGACTGTTCTTCAATG?3′。期望的產物大小為525 bp。GAPDH mRNA的擴增產物為：上游引物5′?ATTCAAGGCACCGTCAAGG?3′；下游引物5′?GGGCCATCGATAGTCTTCTG?3′。期望產物大小為408 bp。擴增產物用2%凝膠電泳分離。302 nm紫外線下觀察分離產物。IFNAR2 mRNA表達=IF?NAR2 mRNA光密度/GAPDH mRNA光密度。

1.2.3 PBMC HCV?RNA、血清 HCV?RNA 載量及HCV基因型的測定：應用線狀基因熒光定量聚合酶鏈式擴增儀測定血清HCV?RNA載量（Bioer技術公司）；應用巢式RT?PCR試劑盒測定PBMC HCV?RNA（華美技術公司）；應用拜耳丙肝病毒試劑盒及拜耳Lipa分析法測定病毒基因型。

1.2.4 療效評價：在治療24周后，HCV?RNA仍陽性者視為無反應（non?response，NR）；治療12周后HCV?RNA檢測不出（＆lt;50 IU/mL）則視為完全應答（com?plete response，CR）；治療24周后，HCV?RNA檢測不出（＆lt;50 IU/mL）則視為部分應答（partial response，PR）。

1.3 統計學處理

數據應用SPSS 11.0進行分析。組間IFNAR2 mRNA檢出率比較應用χ2檢驗。各項指標間的關系應用Pearson′s相關分析。P＆lt;0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況比較

入組患者中沒有孕婦及兒童，男41例，女17例，平均年齡為（43±15.7）歲。急性肝炎組4例患者均為基因2型；慢性肝炎組中14例為基因2型，32例為基因1型；肝硬化組8例患者均為基因1型。在實驗第二階段，32例基因1型患者中，28例患者完成了6個月的抗病毒療程，其中CR 12例，PR 8例，NR 8例。CR、PR及NR患者的ALT水平及體重指數比較均無統計學差異（P＆gt;0.05）。

2.2 PBMC IFNAR2 mRNA的表達

丙型肝炎患者PBMC IFNAR2 mRNA的檢出率為 87.9%（51/58），高于對照組（33.3%，5/15；P＆lt;0.05）。丙型肝炎患者中，男女PBMC IFNAR2mRNA的檢出率及表達水平無統計學差異［90.2%（37/41）和82.4%（14/17），P＆gt;0.05；0.743 5±0.359 7和0.677 1±0.348 0，P＆gt;0.05］。HCV不同感染階段PBMC IFNAR2 mRNA表達結果顯示，急性肝炎組表達水平最高，為1.067 9±0.386 5；慢性肝炎組和肝硬化組PBMC IFNAR2 mRNA表達分別為0.746 5±0.298 2、0.422 5±0.450 3，3組之間差異有統計學意義（P＆lt;0.05），見圖1。

圖1 丙型肝炎患者PBMC IFNAR2 mRNA表達水平Fig.1 PBMC IFNAR2 mRNA expression of HCV patients

2.3 PBMC IFNAR2 mRNA水平與病毒載量的關系

本實驗中，丙型肝炎患者PBMC HCV?RNA陽性率為74.14%（43/58）。PBMC IFNAR2 mRNA水平在PBMCs HCV?RNA陽性者與陰性者間無統計學差異（0.699 9±0.345 9和 0.793 0±0.380 9，P=0.598）。PBMC IFNAR2 mRNA水平與治療前血清中HCV?RNA載量無關（r=0.043，P＆gt;0.05）。PBMC HCV?RNA陽性與陰性者治療前血清HCV?RNA載量無統計學差異［（2.55±3.48）×106和（1.40±1.64）×106，P=0.252］。

2.4 PBMC IFNAR2 mRNA與PBMC HCV?RNA載量、血清HCV?RNA載量及IFN療效間的關系

46例慢性丙型肝炎患者中，28例患者完成了6個月的IFN抗病毒治療。CR患者與PR、NR患者比較，PBMC IFNAR2 mRNA表達水平最高（分別為1.052 1±0.225 6和0.906 2±0.1603、0.483 8±0.202 7，P＆lt;0.05），而PR患者高于NR患者（0.906 2±0.160 3和0.483 8±0.202 7，P＆lt;0.05）。CR組、PR組與NR組間PBMC及血清HCV?RNA載量無統計學差異［分別為（1.81±2.93）×106、（2.78±3.45）×106、（2.44±3.44）×106，P＆gt;0.05］。

3 討論

Ren等［11］報道，HCV感染可上調IFNAR2 mRNA在肝臟中的表達。這種上調可以解釋為機體對病毒感染的一種反應，參與機體清除病毒的免疫應答：機體通過上調IFNAR2 mRNA表達來提高與內源性或外源性IFN的結合，從而加強對病毒的清除。本實驗中，58例丙型肝炎患者PBMC IFNAR2 mRNA的檢出率與表達水平均高于健康對照組。

本實驗結果表明，HCV毒感染不同階段PBMC IFNAR2 mRNA的表達水平不同。急性肝炎組患者檢出率為100%。Ohata等［12］的實驗顯示急性肝炎患者PBMC IFNAR2 mRNA的表達水平高于慢性肝炎組。同時本實驗顯示慢性丙型肝炎患者PBMC IF?NAR2 mRNA的表達水平高于丙肝肝硬化患者，這表明隨著疾病的進展，PBMC IFNAR2 mRNA的表達逐漸下降。Lee等［13］報道，隨著肝臟纖維化程度的進展，肝組織中IFNAR2 mRNA的表達逐漸下降。因此更強調了早期抗病毒治療的重要性。

為了明確PBMC IFNAR2 mRNA表達水平與抗病毒療效的關系，本研究中28例患者應用IFN抗病毒治療。結果表明，CR組及PR組患者PBMC IF?NAR2 mRNA表達水平顯著高于NR組。因此，認為IFN抗病毒療效與PBMC IFNAR2 mRNA表達水平相關。HCV基因型、治療前血清及PBMC中HCV?RNA載量是目前公認的可預測IFN抗病毒療效的病毒學指標［14］，而本實驗表明PBMC IFNAR2 mRNA表達水平與這些指標不相關。因此可得出結論，治療前PBMC IFNAR2 mRNA的表達水平可作為預測IFN抗丙肝病毒療效的獨立因素。

然而，Fujiwara等［15］的實驗表明PBMC IFNAR2 mRNA不能替代肝臟中IFNAR2 mRNA評價IFN抗病毒療效的地位，因此仍需進行更大樣本的實驗研究以進一步明確。

綜上，本實驗表明HCV感染可上調PBMC IF?NAR2 mRNA的表達，PBMC IFNAR2 mRNA在慢性肝炎患者的表達高于肝硬化患者。抗病毒治療前，PBMC IFNAR2 mRNA的水平可作為評價IFN抗病毒療效的獨立因素。目前，長效干擾素聯合利巴韋林是抗病毒治療的最佳選擇。今后應進行長效干擾素聯合利巴韋林更大樣本的實驗及長時間的隨訪以進一步明確此結論。

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