結直腸癌PINCH基因單核苷酸多態性的小樣本檢測

張麗靜，趙增仁，賀新奇，田延鋒

（河北醫科大學第一醫院普外科，石家莊 050031）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是我國最常見的惡性腫瘤之一。病因尚未完全清楚，目前認為主要是環境因素與遺傳因素綜合作用的結果。PINCH是新近發現的LIM（Lin-11、Isl-1和Mec-3）家族中的一員，與腫瘤的侵襲轉移有一定關系［1］。研究發現，PINCH mRNA及蛋白在CRC組織中的表達明顯上調［2，3］。本研究擬采用DNA直接測序方法檢測CRC患者PINCH基因多態性位點，旨在了解CRC患者PINCH基因的遺傳變異情況，探討PINCH基因單核甘酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）與 CRC 的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料：選取36例CRC患者（CRC組）和30例非CRC人群（非CRC組）的基因組DNA作為樣本。CRC患者手術過程中同時留取腫瘤組織標本（36例）及遠端正常黏膜標本（31例）。CRC組：為就診于河北醫科大學第一醫院的未經放化療處理的初診為CRC的患者，其中，男21例，女15例，平均年齡（65.2±10.1）歲，均經組織病理學診斷為 CRC；非CRC組：來自石家莊市，年齡和居住地與病例組匹配。

1.1.2 儀器與試劑：血液標本DNA快速純化試劑盒（康為世紀生物科技有限公司）；TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（10 mmol/L）、Marker、6×DNA Loading Dye及 PCR 產物純化回收試劑盒（生工生物工程有限公司）。GeneAmp PCR儀擴增儀（加拿大BBI公司）；3730測序分析儀（美國ABI公司）；凝膠成像系統（Gene Genius公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA抽提：抽取2組靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，按照DNA抽提試劑盒說明抽提外周血單個核細胞基因組DNA。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性和純度。-20℃保存備用。

1.2.2 引物設計：對PINCH基因外顯子區域進行檢測（其中1號外顯子起始位置差異較大，共計6段不同的序列）。采用DNASTAR引物設計軟件自行設計引物14對。進行BLAST同源性檢索，與其他基因無同源性。引物由生工生物技術有限公司合成，序列見表1。

1.2.3 PINCH基因外顯子區的PCR擴增及產物純化：擴增體系 25 μL：反應緩沖液 2.5 μL，dNTPs（10mmol/L）0.5 μL，引物 F（10 μmol/L） 和引物 R（10 mmol/L）各 0.5 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.2 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O。94℃預變性 4 min；94℃變性 30 s，56℃退火30～60 s，72℃延伸1 min，30～35個循環；72℃延伸8 min，4℃保存。采用膠回收DNA純化試劑盒常規純化PCR產物。取2 μL電泳，其余-20℃保存備用。

表1 PINCH基因擴增引物序列Tab.1 Primer sequence of PINCH gene

1.2.4 DNA測序：對純化產物進行熒光染料循環測序法雙向測序（上海生工生物技術有限公司）。應用Chromas和DNAman軟件對測序結果進行分析比對。

1.3 統計學分析

數據采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析。對PINCH基因的SNP等位基因型頻率采用χ2檢驗進行分析。P＆lt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因組DNA抽提

抽提基因組DNA經分光光度計檢測，OD260/280比值在1.8～2.0之間，DNA電泳結果提示DNA純度及完整性基本達到測序分析的要求。見圖1。

圖1 DNA電泳結果Fig.1 Image of DNA electrophoresis

2.2 PCR擴增與純化

PCR擴增產物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外透射儀觀察，可見目標基因均特異有效地得到了擴增，與實驗設計大小相符，見圖2。

2.3 測序比對結果

對PINCH基因10個外顯子分別進行測序，結果顯示：1號外顯子（6個不同起始點的6段DNA序列）未發現存在堿基改變；從2號外顯子開始，共檢測到10個位點發生改變。其中7個位點可在SNP數據庫中查到，分別是 rs74632558，rs1053766，rs112186831，rs111660688，rs111779374，rs113387660和rs115305258，見表2。另外，有3個位點未在SNP數據庫中查到，其中109276129位于2號外顯子，109292340和109292357分別位于5號和6號外顯子。

圖2 PCR擴增產物電泳結果Fig.2 Electrophoresis image of PCR amplification of PINCH

本研究結果發現：rs112186831，rs111660688，rs111779374，rs113387660，rs115305258 基因型均為同義突變，且在CRC標本和非CRC標本相同，差異無統計學意義。同時發現位于2號外顯子的109276129及分別位于5號和6號外顯子的109292340和109292357位點共計3個SNP在美國國立生物技術信息中心未檢索到。另外發現，rs1053766位于染色體位置 109276178，GCG→GTG，編碼氨基酸由Ala→Val，但是在CRC和非CRC標本間無統計學差異。但是值得注意的是位于Exon 2的rs74632558由CGC→CAC，編碼氨基酸由Arg→His，同時在CRC標本和非CRC標本間其分布有差異。CRC標本中57.7%表現為A/G基因型，而非CRC標本中A/G基因型比例為36.7%，見表3。但在同一患者中，CRC腫瘤組織標本和與其匹配的正常黏膜間A/G基因型比例無統計學差異（P=0.635），見表4。

表2 PINCH基因外顯子測序結果Tab.2 The sequencing results of exon of PINCH gene

表3 rs74632558等位基因型頻率情況Tab.3 The frequency of rs 74632558 allelotype in different groups

表4 rs74632558在腫瘤組織及正常黏膜間的基因型分布Tab.4 The genotype distribution of rs 74632558 in tumor and the normal mucosa

3 討論

研究表明，CRC的發生是多因素、多基因共同作用的結果。PINCH基因在整合素和生長因子信號的傳導中起著十分重要的接頭聯結作用，參與細胞的黏附、遷移等基礎功能，并與多種腫瘤的發展、侵襲及轉移有關［1～8］。人PINCH基因位于染色體2q12.3，基因組大小為152 846 bp（109150857-109303702），由10個外顯子和9個內含子組成。其中1號外顯子中包含6個不同起始點的編碼氨基酸的DNA序列。PINCH蛋白由50～60個氨基酸組成，分子量為37 kDa。研究表明，PINCH在腫瘤的發生及轉移過程中起重要作用。我們的前期研究發現，CRC組織中PINCH蛋白及mRNA的表達較正常黏膜明顯增高，而且PINCH高表達和患者的預后有關。

為了探討PINCH在腫瘤中的高表達是否與基因組突變有關，本研究隨機選取了CRC患者及非CRC人群，采用DNA直接測序方法檢測PINCH基因所有蛋白編碼區堿基的改變，分析了其可能的作用。結果發現PINCH基因存在不同的SNP。SNP是人類基因組中廣泛存在的遺傳變異，主要表現為單個核苷酸的置換，在群體中的分布頻率不低于1%，具有高密度穩定和易于分型檢測的優勢［9］。本研究利用小樣本對特定的研究人群PINCH基因10個外顯子區進行測序，共篩查到10個SNP，約600 bp就可檢測到 1個 SNP。其中 Exon1、3、4和 Exon8～Exon10中未檢測到 SNP，Exon2中共檢測到3個SNP，Exon6中檢測到5個SNP，其中有4個可以在SNP數據庫中檢索到。Exon2中有1個未在SNP數據庫比對中檢索到。而Exon5中亦檢測到有1個位點與SNP數據庫比對未發現，考慮可能為新的SNP位點。

基因調控序列中的SNP可影響基因表達水平［10］。CRC組織中PINCH基因的高表達可能是SNP作用的結果。作為一種多基因遺傳病，CRC的發生發展與機體的遺傳背景有關。目前，在多基因遺傳病研究中，SNP研究顯示出巨大的應用價值。多項研究表明，CRC的發生可能與基因多態性有關［11～13］。本研究采用DNA直接測序方法篩查PINCH基因多態性位點，為進一步了解PINCH基因SNP與CRC的關系奠定基礎。結果發現，位于PINCH基因2號外顯子區的rs74632558在CRC患者中更多的表現為A/G基因型，而非CRC人群中A/G基因型比例降低，因此推測高A/G可能與CRC的發生具有一定相關性。當然，由于本研究選擇的病例數較少，rs74632558是否對PINCH的表達有調控作用尚需要后續加大樣本量證實。

綜上所述，本研究結果表明，利用直接測序法可有效篩查出特定人群PINCH基因存在的SNP，通過估算基因頻率可初步了解SNP在特定群體中的分布情況。預測SNP可能的應用價值為后續利用SNP標志進行CRC風險預測奠定了研究基礎。

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