β-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的體外釋藥特性研究Δ

袁子民，王 博，王 靜，程 嵐（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600）

β-欖香烯（β-Elemene，β-ELE）是一種由抗癌中藥欖香烯揮發(fā)油進(jìn)一步精餾純化，主要去除γ-、δ-欖香烯異構(gòu)體后得到的單體有效成分，具有一定刺激性。為降低其刺激性帶來的不良反應(yīng)、增加其在體內(nèi)肝臟中的分布，筆者采用界面縮聚法制備了肝靶向β-ELE聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒（β-ELE-PBCA-NP）[1]，為考察其釋藥特性，進(jìn)一步預(yù)測其在體內(nèi)釋放情況、體內(nèi)作用時間及規(guī)律；采用透析袋擴(kuò)散法對其體外釋藥特性進(jìn)行了研究，并為其制備工藝及其體內(nèi)試驗提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料

LC-10AP液相色譜儀（日本島津公司）；藥物釋放溶出儀（改裝，上海黃海藥檢儀器有限公司）。

β-ELE原料藥（大連遠(yuǎn)大制藥有限公司，批號：20100812，純度：＞98%）；β-ELE對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100268-200401，純度：＞99%）；β-ELE-PBCA-NP（自制，含量：1 mg/ml）；α-氰基丙烯酸正丁酯（BCA，北京瞬康醫(yī)用膠有限公司）；泊洛沙姆（德國BASF公司，型號：188）；右旋糖酐（西安羅森伯科技有限公司）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

透析袋（截留分子質(zhì)量8000～15000，上海華藍(lán)生物科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 β-ELE-PBCA-NP及空白PBCA-NP的制備

取β-ELE及BCA適量，用丙酮溶解作為有機(jī)相；取泊洛沙姆及右旋糖酐適量，用蒸餾水溶解作為水相，并用0.01 mol/L鹽酸調(diào)pH值至3.0。在室溫、一定轉(zhuǎn)速磁力攪拌下，將有機(jī)相按一定比例緩緩加入水相中，攪拌3 h至有機(jī)溶劑揮盡，用0.01 mol/L NaOH調(diào)pH為7.0，繼續(xù)攪拌0.5 h，過G3漏斗，低溫靜置，即得乳白色泛藍(lán)色乳光的β-ELE-PBCA-NP膠體溶液[1]。同法制得不加β-ELE的空白PBCA-NP膠體溶液。

2.2 β-ELE含量測定

2.2.1 色譜條件。色譜柱：Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（95∶5，V/V），流速：1.0 ml/min；柱溫：室溫；檢測波長：210 nm。

2.2.2 線性關(guān)系考察。精密稱取β-ELE對照品適量，加甲醇制成每1 ml含β-ELE 0.0224 mg的溶液，作為對照品溶液。分別精密吸取β-ELE對照品1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μl，進(jìn)樣測定峰面積，以峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，β-ELE對照品進(jìn)樣量（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為y＝528008x+29.2（r＝0.9994）。結(jié)果表明，β-ELE進(jìn)樣量在0.0224～0.448 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 空白干擾試驗。分別取β-ELE-PBCA-NP、空白PBCA-NP膠體溶液2 ml，分別置于處理好的透析袋內(nèi)，兩端扎緊，按“2.3.1”累積釋放度測定方法，分別于48 h精密量取各釋放介質(zhì)1.0 ml，過0.45 μm微孔濾膜，濾液分別作為供試品溶液、空白對照溶液。精密吸取β-ELE對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液各10 μl，進(jìn)樣測定。結(jié)果，空白對照溶液在與β-ELE相同保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，表明其他成分對主成分含量測定無干擾，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2.4 精密度試驗。精密吸取同一供試品溶液20 μl，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測定色譜峰峰面積。結(jié)果，RSD＝1.6%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗。取供試品溶液，分別于放置0、2、4、6、8 h后進(jìn)樣，測定色譜峰面積。結(jié)果，RSD＝1.5%（n＝5），表明溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗。取β-ELE-PBCA-NP膠體溶液2 ml（約含β-ELE 2 mg左右），置于處理好的透析袋內(nèi)，按“2.3.1”項下的釋放度測定方法，在6 h時分別精密量取6份釋放介質(zhì)各1.0 ml，過0.45 μm微孔濾膜，濾液作為供試品溶液，分別測定釋放介質(zhì)中β-ELE的含量。結(jié)果，RSD＝1.9%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.7 回收率試驗。在空白釋放介質(zhì)中，分別加入β-ELE對照品各3份，使其質(zhì)量濃度分別為5、10、20 μg/ml，進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，β-ELE低、中、高質(zhì)量濃度的平均回收率分別為96.8%、97.7%、98.9%，RSD分別為1.7%、1.9%、1.8%（n＝3）。

2.3 體外釋藥特性研究

2.3.1 β-ELE溶液及β-ELE-PBCA-NP膠體溶液體外累積釋放度的測定。分別取約含2 mg β-ELE的釋放介質(zhì)[即生理鹽水（含50%乙醇和0.5%十二烷基硫酸鈉）]及β-ELE-PBCA-NP膠體溶液2 ml（約含β-ELE 2 mg左右），分別置于處理好的透析袋內(nèi)[2]，兩端扎緊，固定于槳式攪拌器上，置于盛有100 ml釋放介質(zhì)的燒瓶內(nèi)，瓶口密封，擴(kuò)散池37℃恒溫，轉(zhuǎn)速100 r/min。分別在0.5、1、2、4、6、8、12、24、48 h時精密量取釋放介質(zhì)1.0 ml，過0.45 μm微孔濾膜，濾液作為供試品溶液，同時補(bǔ)加1.0 ml釋放介質(zhì)。分別精密吸取2種溶液各10 μl，進(jìn)樣測定，計算β-ELE溶液及β-ELE-PBCA-NP膠體溶液的累積釋放度，并繪制釋藥曲線，結(jié)果見圖2。

由圖2可見，β-ELE溶液8 h的累積釋放度已接近90%；而β-ELE-PBCA-NP膠體溶液48 h累積釋放度為70.8%，且0.5 h的累積釋放度僅為8.7%。

2.3.2 體外釋藥模型的擬合。根據(jù)文獻(xiàn)[3-5]，采用常用的體外釋藥方程對β-ELE-PBCA-NP膠體溶液的體外釋藥數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。結(jié)果，β-ELE-PBCA-NP膠體溶液體外釋藥以Weibull方程擬合最好（r＝0.9977），詳見表1（表中Q為累積釋放度，t為取樣時間）。

圖2 2種溶液的體外釋藥曲線Fig 2 Release curves of 2 kinds of solution in vitro

表1 體外釋藥模型擬合結(jié)果Tab 1 Results of fitted release mode in vitro

2.3.3 釋藥機(jī)制。由圖2釋藥曲線可知，β-ELE-PBCA-NP釋藥分為突釋和緩釋2個過程：0～4 h屬于突釋階段，釋放藥物總量近30%，該部分藥物主要來自未被包裹、黏附在納米粒表面或包埋較淺的藥物分子，使藥物發(fā)生短暫的快速釋放；4 h后結(jié)合在納米粒骨架中的藥物通過骨架的擴(kuò)散或溶解、消化與降解慢慢釋放，從而實現(xiàn)納米粒對藥物的緩釋作用。

3 討論

納米粒體外釋藥特性的研究，常采用透析袋法、生物膜擴(kuò)散等技術(shù)。本試驗采用透析袋擴(kuò)散技術(shù)，該法簡單、易行。透析袋的預(yù)處理方法為先在純凈水中煮沸15 min，然后放入20%乙醇液中浸泡，使用時用純凈水沖洗3次。另外β-ELE量測定采用高效液相色譜（HPLC）法，前期試驗中對流動相進(jìn)行多次篩選，結(jié)果采用甲醇-水（95∶5，V/V）為流動相后，發(fā)現(xiàn)供試品色譜中待測組分分離度良好。

前期試驗中對釋放介質(zhì)進(jìn)行了篩選，采用HPLC法測定β-ELE在含20%乙醇生理鹽水、40%乙醇、含50%乙醇生理鹽水、含0.5%吐溫80及50%乙醇生理鹽水、含0.5%十二烷基硫酸鈉及50%乙醇生理鹽水等釋放介質(zhì)中形成飽和溶液時的平衡溶解度。結(jié)果，β-ELE在含0.5%十二烷基硫酸鈉及50%乙醇的生理鹽水中溶解度達(dá)到331 mg/L，因此選擇其作為釋放介質(zhì)，結(jié)果表明能夠到達(dá)漏槽條件。

本試驗的目的主要是考察β-ELE-PBCA-NP膠體溶液是否具有突釋效應(yīng)及緩釋作用。由釋藥曲線可知，與β-ELE溶液相比，β-ELE-PBCA-NP膠體溶液具有明顯的緩釋作用。

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