LC-MS/MS法測定人血漿中苯海拉明血藥濃度及其制劑的生物等效性研究

劉世軍，曹若明，崔，孫克明，劉憲勇，張 敏，鄭慧敏（.武警山東總隊(duì)醫(yī)院藥劑科，濟(jì)南5004；.濟(jì)南市疾病預(yù)防控制中心，濟(jì)南 500；3.山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)研究所，濟(jì)南 500）

苯海拉明（Diphenhydramine）為抗組胺藥，具有抗組織胺H1受體的作用，對(duì)中樞神經(jīng)有較強(qiáng)的抑制作用，亦有阿托品樣作用，適用于皮膚黏膜的過敏性疾病，如蕁麻疹、枯草熱、過敏性鼻炎等，還可用于預(yù)防暈船、暈車、暈飛機(jī)等暈動(dòng)病。本試驗(yàn)擬建立靈敏、準(zhǔn)確的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧（LC-MS/MS）法測定苯海拉明在人血漿中的血藥濃度，對(duì)其在人體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特性及其生物等效性進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 儀器

API 4000型串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）及Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Applied Biosystem Sciex公司）；1100高效液相色譜儀，包括G1312 A紫外檢測器、G1312 A四元梯度泵、G1313 A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316 A柱溫箱（美國Agilent公司）；AG135電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 藥品與試劑

苯海拉明標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)：100066-200506，純度：99.1%）；富馬酸氯馬斯汀標(biāo)準(zhǔn)品（內(nèi)標(biāo)，中國藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)：100229-200803，純度：99.0%）；受試制劑：氨麻苯美片（瑞陽制藥有限公司，規(guī)格：每片含鹽酸苯海拉明25 mg），參比制劑：氨麻苯美片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司啟東分公司，規(guī)格：每片含鹽酸苯海拉明25 mg），2種制劑含量差異均在5%之內(nèi)。乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨為色譜純，鹽酸、二氯甲烷、正己烷、異丙醇為分析純，水為超純?nèi)ルx子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Inertsil Hilic柱（150mm×3.0mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（10 mmol/L乙酸銨）-甲酸（40∶60∶1，V/V）；流速：0.3 ml/min；柱溫：35℃；離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），正離子掃描方式；電噴霧電壓：4600 V；離子源溫度：450℃；氣簾氣：20 psi；霧化氣：50 psi；輔助氣：40 psi；用于定量分析的苯海拉明和內(nèi)標(biāo)的離子對(duì)分別為m/z 256→152和m/z 344→215。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2.2.1 苯海拉明標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取苯海拉明標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用甲醇配成200 μg/ml的貯備液，并依次稀釋得5、50、500 ng/ml的溶液，4℃冷藏備用。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取富馬酸氯馬斯汀標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，以甲醇-水混合液為溶劑配成200 μg/ml的貯備液，并依次稀釋得10、100、1000 ng/ml的溶液，4℃冷藏備用。

2.3 血樣處理

精密量取血漿樣品0.2ml，加入甲醇-水（50∶50，V/V）0.1 ml，加入內(nèi)標(biāo)（10 ng/ml氯馬斯汀）溶液0.1 ml、磷酸緩沖溶液（pH11）0.2 ml，渦旋震蕩1 min。再加入提取溶劑（正己烷-二氯甲烷-異丙醇（30∶20∶1，V/V/V）3 ml，渦旋振蕩2 min，往復(fù)振蕩15 min，3000 r/min離心10 min。吸取有機(jī)層于另一離心試管中，于35℃水浴上通氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)昧鲃?dòng)相0.1 ml溶解，取5 μL進(jìn)樣分析。

2.4 方法專屬性

對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)二級(jí)質(zhì)譜圖見圖1；高效液相色譜圖見圖2。結(jié)果表明血漿中內(nèi)源物質(zhì)無干擾。

圖1 二級(jí)質(zhì)譜圖A.苯海拉明；B.內(nèi)標(biāo)Fig 1 Ms2spectrogramA.diphenhydramine；B.IS

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取多份空白血漿適量，分別加入定量的苯海拉明標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線系列血漿樣品，其中含藥物質(zhì)量濃度為0.5、2.5、12.5、25、50、125 ng/ml；按照“2.3”項(xiàng)下方法處理，采用加權(quán)（W＝1/X2）最小二乘法進(jìn)行線性回歸，考察苯海拉明標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)的色譜圖峰面積比（y）與相應(yīng)濃度（x）的相關(guān)性。得苯海拉明的直線回歸方程為y＝0.264 x+0.0349（r＝0.9965）。結(jié)果表明，苯海拉明血藥濃度在0.5～125 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.苯海拉明標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)；C.空白血漿+苯海拉明標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)；D.受試者血漿樣品+內(nèi)標(biāo)Fig 2 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.diphenhydramine standard+IS；C.blank plasma+diphenhydramine standard+IS；D.plasma sample of volunteer+IS

2.6 回收率及精密度試驗(yàn)

取低、中、高（1.25、12.5、100.0 ng/ml）3個(gè)質(zhì)量濃度的苯海拉明血漿，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析。計(jì)算準(zhǔn)確度（方法回收率）和絕對(duì)回收率（n＝5）；同日內(nèi)測定5次，計(jì)算日內(nèi)RSD；每日測定1次，連續(xù)測定5 d，計(jì)算日間RSD，結(jié)果見表1。

表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1Results of precision and recovery test（s±s ，n＝5）

表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1Results of precision and recovery test（s±s ，n＝5）

3.384.502.201.40±0.0512.6±0.699.0±2.21.2512.5100.0，1.33±0.1012.4±0.597.6±5.37.344.105.50101.9±6.3103.4±1.299.4±3.272.7±4.675.3±3.971.9±5.2

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取含苯海拉明低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各5份，測定－20℃冷凍保存14 d、2次冷凍-凍融、室溫放置6 h時(shí)藥物的濃度，考察不同存放條件對(duì)苯海拉明穩(wěn)定性的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，苯海拉明在以上存放條件下，質(zhì)控樣本測試結(jié)果RSD均＜8%，提示苯海拉明血漿樣品在上述條件下保存穩(wěn)定性較好。

2.8 樣品采集與測定

健康男性志愿者20名，體質(zhì)量（64.7±4.6）kg。于試驗(yàn)前統(tǒng)一體格檢查，肝、腎功能正常，且無急、慢性疾病及家族遺傳病史。試驗(yàn)前2周內(nèi)無用藥史，3個(gè)月內(nèi)未參加其他新藥臨床試驗(yàn)，志愿者在試驗(yàn)前2周及試驗(yàn)期內(nèi)禁煙、酒。試驗(yàn)前簽定書面知情同意書，試驗(yàn)方案通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。20名健康志愿者單劑量口服氨麻苯美片受試制劑或參比制劑2片，分別于服藥前（0 h）和服藥后0.33、0.67、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、14、24、36h時(shí)取肘靜脈血4ml，肝素抗凝，3500r/min離心5 min，留取血漿，－20℃貯存。采用LC-MS/MS法測定血漿中苯海拉明的濃度，DAS 2.0軟件分析其主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表2；苯海拉明平均藥-時(shí)曲線見圖3。

表2 20名健康志愿者口服氨麻苯美片受試制劑與參比制劑后苯海拉明的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s ，n＝2 0）Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of diphenhydramine in 2 0 healthy volunteers after oral administration of test preparation and reference preparatio（n±s ，n＝2 0）

表2 20名健康志愿者口服氨麻苯美片受試制劑與參比制劑后苯海拉明的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s ，n＝2 0）Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of diphenhydramine in 2 0 healthy volunteers after oral administration of test preparation and reference preparatio（n±s ，n＝2 0）

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圖3 20名健康志愿者口服氨麻苯美片受試制劑與參比制劑后苯海拉明的平均藥-時(shí)曲線（n＝20）Fig 3 Mean plasma concentration-time curves of diphenhydramine in 20healthy volunteers after oral administration of test preparation and reference preparation（n＝20）

3 討論

已有文獻(xiàn)報(bào)道采用液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）法、高效液相色譜（HPLC）法、氣相色譜（GC）法[1-4]等測定血漿中苯海拉明的濃度。但LC-MS法靈敏度欠佳，HPLC法往往專屬性不強(qiáng)、耗時(shí)較長，而GC法在樣品處理上又比較繁瑣。上述方法對(duì)單獨(dú)組分的確定尚存在問題，因此很難滿足同時(shí)測定多種待測物的需要。本研究建立的LC-MS/MS法，血漿樣品用量少，操作步驟簡便易行，且測試速度快，樣品檢測時(shí)間僅3 min。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，該法靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，經(jīng)方法學(xué)的全面考察確證其符合生物樣品測定的要求，適用于苯海拉明血漿濃度測定及其藥動(dòng)學(xué)和生物利用度研究。2種制劑生物等效。

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[2]鄒梅，程剛，安峰.撲苯黃片相對(duì)生物利用度的研究[J].中國藥學(xué)雜志，2002，37（1）：36.

[3]Chao ST，Prather D，Pinson D，et al.Effect of food onbiovailability of pseudoephedrine and brompheniramine administered from gastrointestinal therapeutic system[J].Pharm Sci，1991，80（5）：432.

[4]韓瑩，陳笑艷，謝智勇，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定人血漿中偽麻黃堿和苯海拉明[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38（1）：67.