循環牽張應力對人骨關節炎軟骨細胞增殖的影響*

孫曉雷 趙 斌, 馬信龍,△ 李秀蘭 馬劍雄 李 爽 楊 強

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是關節疾病中最常見的類型之一，其病理過程以軟骨細胞的凋亡和軟骨基質的破壞為特征[1]。軟骨組織是覆蓋在關節面上的無血管特殊結締組織，時刻受到內源性和外源性的力學刺激[2]，一定范圍的力學刺激對維持關節軟骨結構功能的完整性起著重要作用。有研究發現，對體外培養的軟骨細胞加載不同類型的力學刺激，會產生不同程度的細胞生物學變化[3-4]。因此，本實驗對體外培養的人OA軟骨細胞施加不同大小的循環牽張應力，觀察其對細胞增殖的影響，旨在研究循環牽張應力與人OA軟骨細胞力學應答的關系，并為OA的預防與治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM培養基、胎牛血清（Gibco，美國），EDTA、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶（Sigma，美國），多克隆兔抗人Ⅱ型膠原一抗、FITC標記的羊抗兔IgG（博士德，武漢），甲苯胺藍、番紅O染液（東勝泰博，北京）；ElectroForce 3200力學實驗儀、BioDynamic生物反應倉系統（Bose，美國），倒置相差顯微鏡（Olympus，日本），恒溫搖床（Heidolph，德國），流式細胞儀（BD，美國），CO2培養箱（Hera-cell，德國）。

1.2 方法

1.2.1 標本取材 軟骨組織取自1例66歲女性左膝骨關節炎患者，在患者知情同意的情況下于手術治療時取少量軟骨組織，取材時嚴格無菌操作，取材組織部分行病理切片HE染色，參考Collins病理學分級標準對所取組織退變程度進行分級。其余組織均在取材后2 h內進行分離培養。

1.2.2 軟骨細胞體外分離和培養 將所取組織用含抗生素的D-Hank’s液浸泡5 min，再用D-Hank’s液沖洗2遍，去除軟骨組織上沾染的血液和脂肪組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，加入含0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶的消化液，37℃搖床消化30 min；棄去消化液，加入含0.25%胰蛋白酶、0.2%Ⅱ型膠原酶的消化酶搖勻，4℃冰箱過夜消化后，再置于搖床37℃消化2 h，至組織塊基本完全消化。加1 mL FBS終止消化，200目鋼網過濾，將濾液移至離心管，1 500 r/min離心7 min，棄上清，用含10%FBS的H-DMEM培養液重懸，細胞計數板計數，以密度為5×104個/mL接種于底面積為25 cm2的細胞培養瓶。24 h后半量換液，之后2 d換液1次，待細胞達80%～90%融合時消化傳代。

1.2.3 軟骨細胞的鑒定 （1）形態學觀察：倒置相差顯微鏡下觀察軟骨細胞形態。（2）甲苯胺藍染色：第一代細胞爬片至70%～80%融合時，將細胞爬片取出，用新配的4%多聚甲醛固定30 min，1%甲苯胺藍染色10 min，PBS清洗，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察細胞分泌糖胺聚糖的能力。（3）番紅O染色：第一代細胞爬片至70%～80%融合時，將細胞爬片取出，用新配的4%多聚甲醛固定30 min，1%番紅O染色10 min，PBS清洗，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察細胞分泌蛋白多糖的能力。（4）Ⅱ型膠原免疫熒光染色：第一代細胞爬片至70%～80%融合時，將細胞爬片取出，用新配的4%多聚甲醛固定30 min，將爬片固定于載玻片上，0.1%Triton X-100打孔30 min，PBS沖洗；3%H2O215 min滅活內源性過氧化氫酶，PBS沖洗；羊血清封閉液15 min，晾干；滴加1∶100稀釋兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體，濕盒內4℃過夜，PBS沖洗；滴加FITC標記的羊抗兔IgG，避光孵育2 h，PBS沖洗，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 循環牽張應力加載 力學加載采用美國Bose公司BioDynamic細胞力學加載系統，見圖1，該系統以硅橡膠膜為細胞力學加載載體，配合ElectroForce3200動力加載，整個系統由Bose PCI和Win Testing系統聯合控制持續時間、拉伸長度、拉伸頻率等力學參數，使硅橡膠膜產生精確變形，使培養在其上面的細胞同時受到拉伸作用。細胞所受力的大小以硅橡膠膜拉伸應變率（%）表示，應變率越大，表示細胞所受牽張應力越大。取P3代軟骨細胞，調整細胞懸液密度為3×105/mL，將700 μL細胞懸液滴加到4 cm×2 cm大小的硅橡膠膜上，培養24 h后，將其置于BioDynamic生物反應倉內進行力學加載。基于預實驗及文獻[5]報道，實驗分為以下4組：空白對照組（0應變組）、5%拉伸應變組、10%拉伸應變組、15%拉伸應變組，每組3個樣本。加載頻率為0.25 Hz，加載時間為3 h。培養液儲存罐置于37℃5%CO2培養箱中，由管道與反應倉相連。蠕動泵以15 mL/min的速度使培養基在整個系統中循環，以此來保證加載過程中反應倉內的溫度及CO2濃度。

1.2.5 流式細胞儀測定細胞周期 細胞加載結束后，細胞培養箱中繼續培養24 h，給予細胞充分反應時間。酶消化法消化各組細胞，2 000 r/min離心5 min，去上清，用無菌D-Hank’s液輕微漂洗2次，75%冷乙醇固定；細胞2 000 r/min離心5 min，去上清，加入500 μL RNA酶，37 ℃孵育30 min；2 000 r/min離心5 min，去上清，加500 μL碘化丙啶，室溫避光孵育30 min，300目篩過濾，上機。流式細胞儀檢測細胞DNA含量和細胞周期，采用Flow Plus軟件處理數據。根據細胞周期中G0/G1期和G2/M期細胞比例來計算S期細胞比例（%）及細胞增殖指數（proliferative index，PI）。公式為：S期（%）=1-[G0/G1期(%)+G2/M期(%)]，PI（%）=S期（%）+G2/M期（%）。

1.3 統計學方法 采用SPSS 18.0軟件進行分析，數據以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 軟骨組織大體觀及病理表現 大體觀：關節軟骨失去原有光澤，顏色明顯變暗，股骨外側髁關節軟骨表面有缺損，軟骨下骨外露，見圖2A。鏡下可見軟骨縱行裂隙形成，呈纖絨樣變，細胞排列紊亂，在軟骨深層見細胞聚集現象，見圖2B。結合患者臨床及病理資料，關節軟骨為中、重度退變。

2.2 軟骨細胞培養及形態學觀察 倒置相差顯微鏡下示：剛接種的原代軟骨細胞呈圓形或橢圓形，12～16 h開始貼壁生長，細胞核呈圓形，胞質豐富；24 h后貼壁細胞開始伸展、增殖，呈三角形、長梭形或多角形；7 d后增長至爬滿瓶底，胞體豐富，胞漿均勻，核大而圓。傳代后軟骨細胞形態良好，呈克隆樣生長，細胞間互相連接呈“鋪路石樣”狀態。見圖3。

2.3 軟骨細胞鑒定 甲苯胺藍染色結果顯示細胞質呈藍色，說明細胞可分泌糖胺多糖；番紅O染色結果顯示細胞質被染成紅色，說明細胞可分泌蛋白多糖；Ⅱ型膠原免疫熒光染色顯示胞質呈綠色熒光，說明細胞能夠分泌合成Ⅱ型膠原，見圖4。以上結果均提示培養細胞為軟骨細胞。

2.4 不同循環牽張應力對人骨關節炎軟骨細胞增殖的影響 在選定的0、5%、10%及15%4個應變點，隨著刺激的增大，S期細胞百分比先逐漸增加而后減弱，在10%應變組軟骨細胞增殖最佳，5%、10%、15%應變組均高于0應變組（Plt;0.05），10%應變組高于5%應變組（Plt;0.05），但5%、10%應變組與15%應變組比較差異均無統計學意義（Pgt;0.05）。PI亦隨著刺激的增大先逐漸增強而后減弱，各組間比較差異均有統計學意義（Plt;0.05），見表1。

Table 1 Effects of cyclic stretch strain on the proliferation of human degenerative articular chondrocytes表1 不同循環牽張應力對人退變軟骨細胞增殖的影響（n=6，%，x±s）

3 討論

3.1 關節軟骨退變及其修復 OA是關節疾病中最常見的類型之一。流行病學調查顯示，中老年人群中60%有明顯OA的影像學改變[6]。疾病主要累及負重的大關節，其病理過程以關節軟骨基質的降解破壞為特征，而生理學認為成熟的軟骨組織無血液支配，組織損傷后無凝血及炎癥因子的釋放，亦無血液中未分化細胞向損傷部位的遷移，并且軟骨細胞為終末細胞，其增殖和遷移能力極差，因此軟骨損傷與退變后的修復能力很差。另外，軟骨組織沒有神經支配，理論上軟骨細胞通過血液和神經的信息傳導系統接受環境變化的信號極其有限。Wu等[7-8]研究證實軟骨細胞對應變的感應非常敏感，能使細胞獲得環境變化的足夠信息。

軟骨退變是OA共有的基礎病理過程，基于軟骨組織本身特點，認為軟骨退變是一個不可逆轉的過程。但臨床發現OA患者骨贅表面軟骨可分泌Ⅱ型膠原，即證實其軟骨為透明軟骨，且作為對關節退變的代償反應，其透明軟骨是由關節軟骨增殖遷移到周邊骨質的。另有部分OA患者隨著病程發展到一定階段，其臨床癥狀逐漸減輕甚至消失，部分退變軟骨面得到修復并穩定下來；并且進行截骨術矯正關節負重力線后，退變軟骨出現修復現象。以上現象均提示退變的軟骨具有恢復正常生理功能的潛能。

3.2 關節軟骨與細胞力學 關節軟骨在體內處于復雜的生理力學環境[9]。這些機械刺激是維持關節軟骨正常結構和功能的重要因素。岳海濤等[10-11]研究表明周期性機械應力有利于模擬體內的生理環境，能顯著促進組織工程軟骨的質量。Xu等[12]對大鼠終板軟骨細胞加載間歇循環機械張力（0.5 Hz，10%形變，4 h/d，5 d/周），結果發現張力刺激可促進終板軟骨細胞增殖。Thomopoulos等[5]對三維體外培養模型中的骨髓間充質干細胞（MSC）加載循環拉伸張力（1 Hz，10%形變，共培養7 d），結果顯示循環拉伸張力可促進紡錘狀細胞形成，上調Ⅰ型膠原和糖胺多糖（GAG）合成。由此筆者認為，適當的張力可促進軟骨細胞增殖及基質合成代謝，維持軟骨細胞的正常結構和功能，而超出軟骨細胞承載范圍的張力則可能抑制細胞增殖，使細胞結構功能和完整性受到破壞，進而損傷關節軟骨。損傷的軟骨組織承受力學刺激的能力減弱，可能進一步加重力學刺激，形成惡性循環，直至軟骨組織結構及功能完全喪失。

本實驗所用退變關節軟骨為1例66歲老年女性OA患者手術標本，通過病理學方法評價其退變程度。體外分離培養軟骨細胞，對細胞施加不同大小循環牽張應力刺激，觀察應力刺激性細胞的增殖情況。此方法排除了炎性因子以及其他混雜因素的干擾，從細胞水平研究了單純循環牽張應力刺激對軟骨細胞的影響。結果顯示與0應變組相比，各應變組S期細胞百分比與PI均增加，以10%應變組最為明顯，由此認為應力對軟骨細胞增殖有一定影響，并且10%～15%的應變區間可能是人OA軟骨細胞增殖最佳的應力范圍。

Figure 1 The EF3200 mechanical loading system equipped with BioDynamic bioreactor圖1 ElectroForce3200力學加載系統搭載BioDynamic生物反應倉

Figure 2 The degenerated human articular cartilage usedin the experiment圖2 實驗所取退變關節軟骨組織

Figure 3 The degenerated articular chondrocytes圖3 退變軟骨細胞

Figure 4 The identification of degenerated articular chondrocytes圖4 軟骨細胞鑒定

[1]劉興漠,項禹誠,孫青,等.周期性張應力對骨關節炎軟骨細胞p38MAPK表達及其磷酸化的影響[J].中國病理生理雜志,2012,28(2):362-365.

[2]Xu HG,Hu CJ,Wang H,et al.Effects of mechanical strain on ANK,ENPP1 and TGF-β1 expression in rat endplate chondrocytes in vi?tro[J].Mol Med Rep,2011,4(5):831-835.

[3]Moukoko D,Pourquier D,Pithioux M,et al.Influence of cyclic bend?ing loading on in vivo skeletal tissue regeneration from periosteal or?igin[J].Orthop Traumatol Surg Res,2010,96(8):833-839.

[4]Freemont AJ.The cellular pathobiology of the degenerate interverte?bral disc and discogenic back pain[J].Rheumatology(Oxford),2009,48(1):5-10.

[5]Thomopoulos S,Das R,Birman V,et al.Fibrocartilage tissue engi?neering:the role of the stress environment on cell morphology and matrix expression[J].Tissue Eng Part A,2011,17(7-8):1039-1053.

[6]商鵬,陳維毅,衛小春,等.周期性張應變力對幼年和成年及骨關節炎軟骨細胞產生糖胺多糖的影響[J].中國現代藥物應用,2010,4(16):1-3.

[7]Wu JZ,Herzog W.Analysis of the mechanical behavior of chondro?cytes in unconfined compression tests for cyclic loading[J].J Bio?mech,2006,39(4):603-616.

[8]Akisaka T,Yoshida H,Inoue S,et al.Organization of cytoskeletal F-actin,G-actin,and gelsolin in the adhesion structures in cultured osteoclast[J].J Bone Miner Res,2001,16(7):1248-1255.

[9]Hirano Y,Ishiguro N,Sokabe M,et al.Effects of tensile and com?pressive strains on response of a chondrocytic cell line embedded in typeⅠcollagen gel[J].J Biotechnol,2008,133(2):245-252.

[10]岳海濤,范衛民,馬益民,等.不同強度周期性壓力對組織工程軟骨的影響[J].中華創傷骨科雜志,2007,9(7):661-664.

[11]張廣程,范衛民,馬益民,等.不同頻率周期性壓力對組織工程軟骨的影響[J].中華實驗外科雜志,2007,24(6)：677-678.

[12]Xu HG,Zhang XH,Wang H,et al.Intermittent Cyclic Mechanical Tension Induced Calcification and downregulation of ankh gene ex?pression of end plate chondrocyte[J].Spine(Phila Pa 1976),2012,37(14):1192-1197.