何氏加味定喘湯對慢性支氣管炎大鼠內皮素-1及肺組織形態學的影響

周運海,楊 洋

(蘇州市中醫醫院,江蘇蘇州215000)

本實驗通過觀察實驗性慢性支氣管炎大鼠血清、肺組織勻漿中ET-1及肺、支氣管組織病理形態學的改變,探討何氏加味定喘湯對慢性支氣管炎的治療作用。

1 實驗材料

1.1 動物 60只清潔級健康SD大鼠(SPF):蘇州大學動物中心提供。

1.2 藥物 何氏加味定喘湯(煎劑):由百部、炙麻黃、桑白皮、杏仁、炙紫菀、白前、制半夏、橘紅、蘇子、黃芩、象貝母、炙款冬花、炙地龍組成,棕色水煎劑,4℃貯存;止嗽合劑,由蘇州市中醫醫院制劑室生產提供。

1.3 試劑及儀器 ET-1放免試劑盒由北京華英生物技術研究所提供,批號:20110525。XHF-D內切式勻漿機由上海京工實業有限公司生產。

2 實驗方法

2.1 造模及給藥 除空白對照組外,其余各組用煙熏法造模。造模參照文獻[1]法,采用改良煙熏法復制:1)將造模組大鼠共42只置于90 cm×60 cm×60 cm的煙室中,煙室上方開一0.4 cm×60 cm的縫隙,下面外接回活塞通氣管具。通氣管具活塞端接煙條,后端接50 mL注射器。2)將鋸末、旱煙條各12 g混合均勻,卷成每支8 g左右的煙條。將煙條接在活塞端,點燃煙條,抽動活塞即可順利通入。3)煙熏大鼠:共30 d,其中前20 d每日2次,每次30 min,每次用煙條3支,每隔10 min加入1支;后10 d每天1次,方法同上。4)第20天時,取模型對照組大鼠2只。斷頸處死,取右肺中部組織在福爾馬林中固定,再經過脫水、浸蠟、包埋等處理,切片,常規HE染色做成病理切片光鏡下觀察,證明慢性支氣管炎已經形成,造模成功。5)從造模第20天起,空白對照組及模型對照組用生理鹽水1 mL/100 g,給藥組按1 mL/100 g灌胃,陽性對照組用止嗽合劑5 g/(kg·d)灌胃,何氏加味定喘湯高、中、低劑量組分別以 20 g/(kg·d)、10 g/(kg·d)、5 g/(kg·d)劑量灌胃,各組均為每日 1次。各組均用藥20 d。

2.2 檢測方法 血清制備:術前8 h禁食不禁水,末次給藥1 h后,稱重大鼠,用4%的水合氯醛腹腔注射麻醉。剪開腹部皮膚,紗布保護撥開腹腔內容物,暴露腹后壁,鈍性分離腹主動脈,抽取腹主動脈血5 mL,4℃,制備血清,-20℃凍存待檢;另抽取腹主動脈血2 mL,4℃,放入真空采血管EDTA抗凝管,制備血漿,-20℃冰存待檢。

肺組織勻漿的制備:將左側肺組織用冰生理鹽水沖洗,濾紙吸濕后,稱取濕重0.3 g左右,加入預冷的生理鹽水,用電動勻漿器制成10%的肺組織勻漿,4℃,6 000 r/min離心5 min,提取上清液,-20℃凍存待檢。

肺病理組織制備:取左側肺臟中部組織0.5 cm×0.5 cm,用福爾馬林溶液固定,待檢。

檢測方法:采用放免法測定大鼠血漿及肺組織勻漿中ET-1的含量,樣本冷凍快遞至北京華英生物技術研究所,由該研究所負責檢測。肺組織切片,HE染色,光鏡觀察肺與支氣管的組織形態學變化。

3 結果

3.1 何氏加味定喘湯對慢性支氣管炎大鼠血清、肺組織勻漿中ET-1含量的影響 見表1。

表1 何氏加味定喘湯對慢性支氣管炎大鼠血清、肺組織勻漿中 ET-1的影響(±s,n=10)

表1 何氏加味定喘湯對慢性支氣管炎大鼠血清、肺組織勻漿中 ET-1的影響(±s,n=10)

注:與正常對照組比較:#P<0.05,##P<0.01;與模型對照組比較:△P<0.05,△△P<0.01。

組 別 血清ET-1/(pg/mL)肺組織勻漿ET-1/(pg/mL)正常對照組 54.96±6.89 22.80±2.12模型對照組 105.88±11.17## 28.34±3.30#何氏加味定喘湯低劑量組 90.14±10.97## 26.08±3.41何氏加味定喘湯中劑量組 76.18±10.29△# 25.67±4.27何氏加味定喘湯高劑量組 61.16±6.07△△ 22.20±4.06△陽性對照組(止嗽合劑) 68.11±8.25△△ 23.11±3.88

3.2 何氏加味定喘湯對慢性支氣管炎大鼠肺與支氣管組織形態的影響 實驗結果顯示:慢性支氣管炎大鼠支氣管纖毛柱狀上皮變性、壞死脫落,再生的上皮杯狀細胞增多,并發生鱗狀上皮化生;管壁平滑肌斷裂、萎縮,管壁充血水腫,淋巴細胞、漿細胞浸潤;支氣管管腔變狹窄,炎癥向管壁周圍組織及肺泡擴展。何氏加味定喘湯隨著劑量的增加,其病理改變程度逐漸減輕。何氏加味定喘湯低劑量組大鼠仍有支氣管纖毛柱狀上皮變性、壞死脫落現象;管壁平滑肌斷裂、萎縮,充血水腫,淋巴細胞、漿細胞浸潤程度較模型組均有所減輕;何氏加味定喘湯中、高劑量組支氣管管壁平滑肌均很完整,管壁充血水腫現象還存在,淋巴細胞、漿細胞浸潤明顯減輕(見圖1)。

4 討論

慢性支氣管炎多屬中醫的“咳嗽”“喘證”“痰飲”范疇。[2-3]慢性支氣管炎病情雖復雜,證型變化頗多,但李鴻娟主任認為臨床上最常見的只有3個證型,包括痰熱蘊肺型,脾腎兩虛、痰濁阻肺型,脾腎陽虛型,其他證型在此3型的基礎上辨證,處方靈活加減運用,就可舉一反三,執簡馭繁了[4]。定喘湯出自《攝生眾妙方》,全方由麻黃、白果、蘇子、黃芩、半夏、桑白皮、杏仁、款冬花、甘草等9味組成,具有清肺降氣、清熱化痰功效,是治療風寒外束、痰熱內蘊之喘證的代表方。何氏定喘湯在原方的基礎上去白果,加百部,炙紫菀,白前,橘紅,象貝母,炙地龍化裁而成,全方具有宣肺平喘、清熱化痰、解痙止咳作用,寒溫同用、宣降并進[5]。呼吸系統含有豐富的ET,同時也存在著ET受體,并且已證實內皮素是已知最強的氣管和支氣管平滑肌收縮劑,它有3種異構體,分別是ET-1、ET-2、ET-3,其中以ET-1作用最強[6],并且ET-1還是一重要的前炎癥因子[7]。有研究發現,在慢性支氣管炎鼠模型上,BALF、血漿及肺組織ET-1水平顯著增加,與氣道炎癥損傷指標呈顯著正相關[8]。隨著慢性支氣管炎癥的加重,逐漸向肺氣腫、肺心病進展時,血漿中ET-1逐漸增高[9]。

圖1 何氏加味定喘湯對慢性支氣管炎大鼠肺與支氣管組織形態的影響

本實驗研究發現,慢性支氣管炎大鼠血清、肺組織勻漿中ET-1較正常組顯著增加,何氏加味定喘湯可劑量依賴地逆轉這些改變,高劑量組均接近正常水平,與模型組比較具有非常顯著的差異。提示何氏加味定喘湯可通過有效抑制ET-1的產生,控制肺部慢性炎癥,延緩疾病進展。慢性支氣管炎的病理改變主要表現為支氣管上皮細胞變性、壞死、脫落,后期出現鱗狀上皮化生,纖毛變短、黏連、倒伏、脫失。運用煙熏法造模,病理切片可見大鼠支氣管纖毛柱狀上皮變性、壞死脫落,再生的上皮杯狀細胞增多,并發生鱗狀上皮化生;炎癥向管壁周圍組織及肺泡擴展。何氏加味定喘湯低劑量組大鼠仍有支氣管纖毛柱狀上皮變性、壞死脫落現象,但中高劑量組無這些病理改變,提示隨著劑量增高,何氏加味定喘湯改善支氣管纖毛病理損傷,促進纖毛功能的恢復,利于氣道分泌物的排出;何氏加味定喘湯中、高劑量組支氣管管壁平滑肌均很完整,炎癥控制明顯,雖然管壁充血水腫現象還存在,但淋巴細胞、漿細胞浸潤明顯減輕,顯示很好的治療效果。

[1]李慶云,黃紹光,吳華成.大鼠吸煙致慢性支氣管炎模型氣道炎癥研究[J].上海第二醫科大學學報,2004,24(1):31-35.

[2]李潔,任世禾.慢性支氣管炎的中醫藥治療[J].吉林中醫藥,2012,32(8):786-788.

[3]張成新,徐靜,趙曉琴.淺談慢性支氣管炎從痰飲辨治[J].新疆中醫藥,2002,20(2):1-2.

[4]陳擁軍,龐曉鐘.李鴻娟主任醫師治療慢性支氣管炎經驗[J].吉林中醫藥,2008,28(1):10-11.

[5]何煥榮.加味定喘湯[J].江蘇中醫藥,2008,40(3):14.

[6]蔣連強.內皮素對呼吸系統疾病影響研究想在[J].華夏醫學,1998,11(6):849.

[7]Sabater JR,Otero R,Abraham.W.M,et al.Endothelin-1depresses thacheal mucus velocity in ovine airways via ET-A receptors[J].AmJ Respir Crit Care Med,1996,154:341-345.

[8]方秋紅,趙鳴武.慢性支氣管炎大鼠內皮素和腎上腺髓質素水平的變化及牛磺酸的作用[J].北京醫科大學學報,2000,32(8):13.

[9]江和平,姜文明.慢性肺疾病患者血漿內皮素-1、一氧化氮、血液流變學變化的關系[J].山東醫藥,2009,49(3):67.