通腦飲對大鼠腦梗死組織血管神經再生的影響

韓 漾,吳明華,馬 立,梁 森

(1.南京中醫藥大學,南京 210029;2.江蘇省中醫院腦病中心,南京210029)

腦梗死,又稱缺血性卒中,中醫稱之為卒中或中風,主要表現為神經功能缺損癥狀而嚴重影響中老年患者身心健康和生活質量的腦血管疾病,其中缺血性腦梗死占43.7%～78.9%[1]。其主要特點是高發病率、高致殘率、高病死率、高復發率,為社會及家庭帶來嚴重經濟負擔。采用中藥早期治療,可預防腦梗死進一步進展。本實驗旨在為中藥制劑通腦飲(組成:天麻、鉤藤、石斛、川芎、赤芍、制南星、天竺黃、僵蠶、地龍、水蛭)提供實驗室研究依據。

1 實驗材料

健康成年雄性SD大鼠(由南京中醫藥大學動物實驗中心提供)24只,體質量(300±30)g,隨機分為假

手術組8只,模型組16只。參照《現代神經科學研究方法》[2]中所述的線栓法制作大鼠大腦中動脈局灶性缺血再灌注(MCAO)模型。假手術組手術步驟基本同MCAO模型大鼠,但只分離、暴露血管,不結扎頸總動脈及頸外動脈,不插入釣魚線。將模型組大鼠于術后隨機分為對照組8只和給藥組8只,經24 h后分別通過灌胃給藥法給予等量等滲生理鹽水或通腦飲(江蘇省中醫院提供),4 mL/次,2次/d,共14 d。

2 實驗方法

2.1 神經功能測定 參照《現代神經科學研究方法》[2]采用神經功能缺損評分標準(NSS),每組均設4個時間點,于術后2 h,1 d,7 d,14 d進行評價。評分標準:無任何異常行為,0分;提起鼠尾,健側前肢內旋、肩內收為損傷較輕,1分;上述癥狀基礎上,置于光滑平面,向健側推擋時阻力減弱或動物轉圈追尾爬行,為中度損傷,2分;提起鼠尾,向患側旋轉,損傷較嚴重,3分;動物處于精神抑制狀態,不能進行自發活動,4分。0分及4分的大鼠不予入組。

2.2 熒光定量PCR法檢測VEGF,bFGF,SDF-1,CXCR4基因表達水平 至14 d,模型組中每組選取3只斷頸處死,按照試劑盒說明提取細胞總RNA,并逆轉錄成cDNA,根據SYBRGreenⅠ說明書進行熒光定量PCR擴增。PCR引物序列如下。VEGF,P1:5’-CAAAG CCAGCACATAGGAGAGA-3’,P2:5’-CTATCTTTCTTTGGTCTGCATTCAC-3’,PCR 產物為 71 bp;bFGF,P1:5’-CATCAAGGGAGTGTGTGCGA-3’,P2:5’-CCAGTTCGTTTC AGTGCCAC-3’,PCR 產 物 為 174 bp;SDF-1,P1:5’-GCATCAGTGACGGT AAGCCAG-3’,P2:5’-GCAACAATCTGAAGGGCACA-3’,PCR 產物為 7 133 bp;CXCR4,P1:5’-ACACCGTCAACCTTTACAGCA-3’,P2:5’-CAGGGATAGTC AGGAGGAGGG-3’,PCR 產物為 165 bp;rat actin,P1:5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’,P2:5’-TTT AATGTCACGCACGATTTC-3’,PCR產物為150 bp。PCR擴增反應體系 :模板 25 μ L,上 、下游引物各1 μ L,Sybr green I(20 ＊)0.5 μ L,模板 ＊(cDNA)2 μ L,DEPC,20.5 μ L,總反應體積為50μ L。擴增條件的設置:94℃預變性4min,94℃變性20 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共循環35次,72℃檢測信號。熒光定量PCR儀:FTC2000(Canada)。所有樣本均重復檢測3次,計算出Ct值。

2.3 統計方法 應用SPSS 13.0軟件進行統計分析。數據均已均數±標準差(±s)表示,采用單因互方差分析,再用 LSD法進行 2組之間均數比較,以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 神經功能評分 術后2 h、1 d、7 d、14 d,對照組評分分別為(2.5±0.5),(2.6±0.5),(1.8±0.3),(1.6±0.5)分;治療組分別為(2.7±0.5),(2.6±0.5),(1.5±0.5),(1±0.5)分;假手術組無神經功能缺損癥狀,見圖1。

由圖分析可知:對照組大鼠神經功能缺損在1 d達到高峰,有自發恢復趨勢;治療組大鼠神經功能缺損隨時間逐漸改善,以術后7 d后改善顯著。2組各個時間點采用 t檢驗,分別為:0.33,1,0.04,0.03,可見通腦飲能明顯改善大鼠急性腦梗死后的神經功能功能缺損。

3.2 熒光定量PCR檢測結果 治療組與對照組腦梗死組織中的VEGF,bFGF,SDF-1,CXCR4的CT值與內參CT值檢測結果,并對各CT值采用2-△△CT進行標準化處理,得到各基因的相對表達量,對照組:(0.479±0.128),(0.140±0.028),(0.469±0.108),(6.082±1.534),治療組:(0.982±0.134),(0.259±0.030),(0.959±0.191),(12.002±1.888),見圖 2。對各基因相對表達量行獨立樣本 t檢驗,P均<0.05。由上可知,治療組較對照組大鼠腦梗死組織中VEGF,bFGF,SDF-1,CXCR4基因表達量明顯增加,差異具有統計學意義。假手術組大鼠無腦梗死癥狀。

圖2 熒光定量PCR檢測結果

4 討論

中醫學的“中風”包含西醫范疇的缺血性腦梗死、腦栓塞、腦出血等,其基本病機總屬陰陽失調,氣血逆亂。其病理因素不外虛(陰虛、血虛)、火(肝火、心火)、風(肝風、外風)、痰(風痰、濕痰)、氣(氣滯、氣逆)、瘀(血瘀)六端,腦卒中急性期最多見的癥候是風證、瘀證、痰證,痰瘀互結是腦卒中急性期發作后的基本病機,可見腦卒中急性期,應予息風化痰、活血化瘀為主[3],《醫學衷中參西錄》中也明確指出:“化其腦中瘀血,方能奏效”。痰瘀阻絡方通腦飲,以經典方劑滌痰湯、天麻鉤藤飲和通竅活血湯化裁加減而成,具有平肝息風與活血化痰共治作用,使痰化而血行、血行則痰清,氣血流暢,以達治療之效[4]。此方經過臨床療效觀察,如吳明華等[5]對40例患者應用此方并進行臨床觀察,證實其能顯著改善急性腦梗死患者的臨床神經功能缺損,提高日常生活活動能力。

眾所周知,缺血性腦梗死后可造成嚴重的神經功能的缺失,這種神經功能的缺失是由于各種原因所致的局部腦組織區域血液供應障礙,導致腦組織缺血缺氧性病變壞死。缺血缺氧是觸發血管生成的重要因素,血管生成的啟動需要眾多細胞因子的參與,主要包括血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、基質細胞衍生生長因子-α(SDF1-A)與其受體CXCR4。VEGF是一種特殊的內皮細胞因子,具有神經營養、神經保護、抗凋亡等作用,與腦組織缺血損傷關系密切[6]。陳林等[7]經實驗研究結果示VEGF因子的表達1/2 h出現上調,并在24 h達到高峰,隨后表達有所下降,在168 h時表達又有所增加。bFGF在體內廣泛分布,具有很強的生物學活性,其促進新的血管形成,bFGF誘導內皮細胞形成血管是通過VEGF來實現的。在低氧狀態下,堿性成纖維細胞生長因子可促進培養的血管平滑肌細胞VEGF的表達。SDF-1-CXCR4軸可通過干擾SDF-1-CXCR4軸使干細胞有骨髓流出進入外周血液循環,到達缺氧缺血性腦損傷部位,EPC能在缺血區分化成成熟的血管內皮細胞,促進新血管形成,從而改善缺血組織的血液供應[8]。SDF-1/CXCR4軸同時也能促進血管增生,表現在在SDF-1與VEGF之間存在相互作用,VEGF能夠誘導內皮細胞中SDF-1的表達,而SDF-1也能誘導VEFG的表達。

本實驗通過建立大鼠MCAO模型,神經功能評分明確通腦飲對于大鼠神經功能恢復有積極作用,并通過熒光定量PCR檢測證實通腦飲可上調VEGF,bFGF,SDF-1/CXCR4基因表達,初步明確了通腦飲可促進急性腦梗死后血管的再生。

[1]李衛征,郝子龍,吳波.急性缺血性卒中溶栓治療進展的循證醫學證據[J].中國現代神經疾病雜志,2009,9(5):414-416.

[3]趙楊,虞鶴鳴.中風中醫特色療[M].北京:人民軍醫出版社,2012:96-99.

[4]江淑婷,吳明華.天麻通腦飲治療急性腦梗死痰瘀阻絡證的臨床療效觀察[J].疑難病雜志,2011,10(5):328-330.

[5]吳明華,胡華白,張秀勝.自擬痰瘀阻絡方治療急性腦梗死痰瘀阻絡證的臨床療效觀察和磁共振波譜分析[J].四川中醫,2012,30(9):60-61.

[6]章露易,陳忠.VEGF與中樞神經系統疾病的關系[J].浙江大學學報,2009,38(6):644-648.

[7]陳林,陳紹華,陳繼英.SD大鼠腦梗死急性期血清HIF-1α、VEGF因子的變化特點及相關性研究[J].樂山師范學院學報,2012,27(12):13-18.

[8]李士勇,鄧宇斌.SDF-1/CXCR4軸在缺氧缺血性腦損傷中的研究進展[J].生命科學,2008,20(3):463-466.