急性心肌梗死后TGF-β1/Smad3通路的表達及活血化瘀中藥的干預

趙海濱,張秀靜,王 帥,郭 夢,馬 迪,許曉英

(北京中醫藥大學第三附屬醫院,北京100029)

急性心肌梗死(AMI)后的心肌重塑與心臟破裂、室壁瘤形成及心力衰竭等嚴重并發癥密切相關,在AMI死亡率及預后中起至關重要的作用[1]。根據有關實驗表明:TGF-β1/Smads信號通路的過度激活在誘發并加重AMI后心肌重塑病理過程中居關鍵地位[2]。活血化瘀法以中醫“祛瘀血、生新血”為理論基礎,對AMI后心肌重塑療效肯定,本課題組通過研究活血化瘀中藥對TGF-β1/Smad3通路的影響,探討活血化瘀法對急性心梗后心肌重塑的效應機制,為活血化瘀法治療急性心梗后心肌重塑提供實驗依據。

1 實驗材料

成年清潔級Wistar大鼠50只,體質量(250±10)g,由北京中醫藥大學東直門醫院動物實驗中心提供,合格證明:0240574;試劑用藥血塞通軟膠囊由昆明圣火制藥有限責任公司提供,批號:Z19990022;AMD3100(基質細胞衍生因子-1受體阻斷劑),由北京啟維益成科技有限公司提供,批號:239820-5MG;總RNA試劑提取盒由康為世紀提供;5×SYBRGreen PCRMaster Mix為AB Applied Biosystems公司產品,dNTP為Solarbio公司產品,OligodT、Rnasin、M-MLA 為 promega公司產品,引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成;采用AgilentTechnologiesstratagene M×3 000 P熒光定量儀。

2 實驗方法

2.1 動物模型制作 用隨機數字表法將大鼠分為正常組、假手術組、模型組、活血化瘀組、AMD3100組,每組10只,分籠飼養。

模型組:參照文獻[3-4]制備AMI大鼠模型,鹽酸戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉,經口氣管插管行小動物呼吸機輔助呼吸,有氧正壓通氣,潮氣量5～6 mL,呼吸比1∶2,呼吸頻率80次/min。連接標準12導聯,記錄大鼠心電圖。經左前胸廓旁第3,4肋間逐層開胸,暴露心臟,分離心包,在肺動脈圓錐和左心耳交界處用5～0號絲線結扎左冠狀動脈前降支(LAD)近端制成心肌梗死模型,以心電圖出現壞死性Q波判斷為可能心肌梗死,若無病理性Q波,則再次結扎,以提高心肌梗死模型成功率,然后逐層縫合心腔,術后常規抗感染治療。

活血化瘀組:制備AMI大鼠模型,術后立即灌胃給藥,給藥量按《藥理實驗方法學》所示劑量換算法計算[5]:200 g大鼠計量(g/kg)=人的劑量1g/(kg·d)×0.018。每天灌胃1次,共用7 d。

AMD3100組:制備AMI大鼠模型,第6天腹腔注射AMD3100(5 mg/kg),余同模型組大鼠。

假手術組:大鼠經歷上述手術過程,絲線從冠狀動脈下穿過但不結扎。

正常組:不做造模處理。

2.2 實時熒光定量PCR檢測各組心肌組織TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表達水平 1)心肌組織總RNA的提取,心腔內注射10%氯化鉀使心臟停跳于舒張期,迅速取下心臟,去除心房大血管及心臟外結締組織,沖洗干凈,分別置于液氮中保存。余下左室用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋。在冰塊上切取50～100 mg的心肌組織塊,采用試劑盒提取組織的總RNA,操作按說明進行。A260/A280=1.8～2.0,并計算出RNA含量。2)cDNA的合成,RNA樣品取10 μ g,依次加入 5 ×RT buffer 5μ L,Olig o(dT)1 μ L,NTP 1 μ L,RNA sin 1 μ L,M-MLA 反轉錄酶1 μ L,無 RNase 水補足至總體積 25 μ L。反應條件:42 ℃1 h;95 ℃15 min,4℃10 min。得RT終溶液即為cDNA溶液。3)實時定量PCR,每種組織均以TGF-β1mRNA 和β-actin基因引物進行定量PCR反應,每管設3個復孔,在96孔PCR板中進行。TGF-β1引物序列:上游引物5’-GTGTGGAGCAACATGTGGAACTCTA-3’,下游引物 5’-TTGGTTCAGCCACTGCCGTA-3’,產物 143 bp。Smad3上游引物 5’-GTCAACAAGTGGTGGCGTGT G-3’,下游引物5’-GCAGCAAAGGCTTCTGGGATAA-3’,產物 150 bp。內參 β-actin引物序列:上游引物 5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’, 下游引物 5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’,產物150 bp。反應條件:95 ℃,10 s;95℃,30 s;55℃,30 s,共40個循環。每一例樣本反應結束后由計算機自動計算并讀出定量結果Ct值,Ct值采用2-△△Ct法進行相對定量。

2.3 病理形態學檢查 于上述各組處死大鼠,取心肌組織,用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片HE染色。常規HE染色在光鏡下進行病理觀察。

2.4 非梗死區膠原蛋白測定 采用Mallory’s Trichrome染色法測定非梗死區膠原含量,心肌呈紅色,膠原呈藍色。顯微鏡下每張切片隨機選取8個非血管區視野,應用計算機圖象分析軟件IPWin32采圖系統進行圖片采集,計算機圖象分析軟件Imageproplus 6.0以相對著色面積進行定量分析,取8個視野的平均值。

2.5 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件,采用單因素方差分析t檢驗。所得數據均用均數±標準差±s)表示,以P<0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 心肌組織病理學觀察 HE染色結果顯示,正常組大鼠心臟組織切片,心肌細胞為短柱狀,每個心肌細胞有個圓形的核,位于細胞中央呈藍色,有的細胞為雙核結構;細胞核的兩端肌漿較多,細胞質呈紅色;心肌細胞有分枝,彼此相連成網,排列緊密;心肌細胞分層或分成許多束,且在心肌層或心肌束之間,有結締組織和毛細血管,有呈紅色的血細胞分布;整體呈現正常心肌膜組織。

假手術組大鼠心臟組織切片,心肌細胞為短柱狀,每個心肌細胞有個圓形的核,位于細胞中央呈藍色,有的細胞為雙核結構;細胞核的兩端肌漿較多,細胞質呈紅色;心肌細胞有分枝,彼此相連成網,排列緊密;心肌細胞分層或分成許多束,在心肌層或心肌束之間,有結締組織和毛細血管,有呈紅色的血細胞分布;有成纖維細胞排列存在,其核圓形或桿狀呈藍色;整體呈現正常心肌膜組織。

模型組大鼠心臟組織切片,心肌細胞為短柱狀或圓形且個大,數量較少且散在;每個心肌細胞有個圓形的核,位于細胞中央或邊沿呈藍色,有的細胞為雙核結構;細胞核的兩端或周圍肌漿較多,細胞質呈紅色。結締組織整片廣布,炎性細胞聚集,核大圓形藍色,細胞質較少;成纖維細胞多,扁平狀結構,核扁卵圓形藍色,胞質呈粉紅色;淺粉紅色膠原成分較多;小動脈個大,內皮及平滑肌形態清晰;可見毛細血管和淋巴管結構。整體呈現心肌梗死(重癥)心肌膜組織。

活血化瘀組大鼠心臟組織切片,心肌細胞為短柱狀,每個心肌細胞有個圓形的核,位于細胞中央呈藍色,有的細胞為雙核結構;細胞核的兩端肌漿較多,細胞質呈紅色;心肌細胞有分枝,彼此相連成網,排列疏松。心肌細胞間有大量炎性細胞聚集,核大圓形藍色,胞質少;心肌細胞間還有少量成纖維細胞散在,扁平狀結構,核扁卵圓形藍色,胞質呈粉紅色。整體呈現心肌炎心肌膜組織。

AMD3100組大鼠心臟組織切片,心肌細胞為短柱狀,每個心肌細胞有個圓形的核,位于細胞中央呈藍色,有的細胞為雙核結構;細胞核的兩端肌漿較多,細胞質呈紅色;心肌細胞有分枝,彼此相連成網,排列疏松,心肌細胞間結締組織充斥且與整片結締組織相連。有結締組織整片占據切片較大區域,炎性細胞散在,核大圓形藍色,胞質少;成纖維細胞多,扁平狀結構,核扁卵圓形藍色,胞質呈粉紅色;淺粉紅色膠原成分較多;紅細胞聚集且多。整體呈現心肌梗死(輕癥)心肌膜組織。

3.2 非梗死區膠原蛋白測定 結果顯示:模型組與假手術組相比較,非梗死區膠原沉積明顯(P<0.05),活血化瘀組與模型組相比較膠原沉積降低(P<0.05),見表1。

表1 各組非梗死區膠原蛋白測定結果(±s,n=10)

表1 各組非梗死區膠原蛋白測定結果(±s,n=10)

注:與假手術組比較,△P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

組 別 膠原蛋白含量/%假手術組 3.42±0.47模型組 6.03±0.54△活血化瘀組 5.10±0.36#AMD3100組 5.06±0.27#

3.3 實時熒光定量PCR檢測 結果顯示:模型組與假手術組相比,TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表達均增加(P<0.05)。活血化瘀組較模型組TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表達有所降低(P<0.05)。活血化瘀組與AMD3100組相比較 TGF-β1mRNA、Smad3mRNA 差異無統計學意義(P>0.05),見表2。

表2 各組心肌組織TGF-β1mRNA、Smad3mRNA實時熒光定量結果(±s,n=10)

表2 各組心肌組織TGF-β1mRNA、Smad3mRNA實時熒光定量結果(±s,n=10)

注:與假手術組比較,△P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

組 別 TGF-β1 Smad3假手術組 0.86±0.03 0.43±0.07模型組 1.12±0.12△ 1.07±0.13△活血化瘀組 0.97±0.06# 0.86±0.11#AMD3100組 0.95±0.01# 0.82±0.02#

4 討論

西醫學治療AMI后心肌重塑,主要使用粒細胞集落刺激因子、AMD3100、粒巨細胞集落刺激因子等作為心肌梗死后干細胞“歸巢”的有效動員劑,相關研究表明治療AMI后心肌受損的有效性確切。本實驗證實AMD3100治療AMI后心肌受損的有效性。

中醫學認為,心肌梗死屬中醫“胸痹”“真心痛”的范疇,表現為本虛標實[6],是血道閉塞,血脈不通,瘀血滯塞脈絡所致,以“血氣不至”“血凝而不流”“血瘀滯不行”等為主要病理機制,以胸悶胸痛、心悸氣短等為主要癥狀。本實驗通過祛瘀生新法對大鼠急性心梗后心肌重塑的作用及對TGF-β1/Smads通路的干預發現,祛瘀生新組較模型組TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表達有所降低(P<0.05),而Smad7mRNA表達增加(P<0.05),膠原含量明顯降低(P<0.05),心肌組織損傷也有所減輕。本實驗證實中醫祛瘀生新法對急性心梗后心肌重塑有一定抑制作用,這為防治心肌梗死后心肌重塑的中醫藥治療研究提供實驗依據。

本研究結果表明:TGF-β1/Smads通路作為關鍵調控因子參與心肌梗死后的心肌重塑過程,祛瘀生新中藥可能通過對其表達的活化調控,從而有效改善心肌梗死后的心肌重塑。其作用機制可能是:祛瘀生新中藥對TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表達的負性調節作用,同時增加Smad7mRNA的表達。至于祛瘀生新法是否還有其他的活化調控機制,還有待進一步深入研究。

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[6]陸孝成.中西醫結合臨床治療冠心病[J].吉林中醫藥,2011,31(4):307.