利用響應面優化生物制麥工藝

班省華，張懷予，彭 濤，*，王千存，劉 琦，路宏科，牛宏亮

(1.甘肅省輕工研究院，甘肅蘭州730000;2.甘肅農業大學，甘肅蘭州730070)

中國是世界啤酒大國，產量多年居世界第一且保持快速增長趨勢，國產啤酒大麥的種植和加工業也呈現快速的發展［1］。但國產大麥存在大麥蛋白質質量分數高、胚乳溶解性差、浸出率較低等質量缺陷［2］。近年來研究發現，制麥過程中添加一些有益微生物菌株可提高成品麥芽的品質，如德國的乳酸麥芽目前應用比較廣泛，比利時的根霉麥芽也已進入了中試生產階段［3］。生物制麥時有益微生物會在制麥過程中分泌水解酶系或利用自身菌絲，協助麥芽溶解［4］。白地霉(Geotrichum candidum Link)是綠麥芽及焙燥麥芽中自然菌群組成菌種之一，毒理學研究表明其安全、無毒素遺傳性［5］。將白地霉菌株添加到制麥工藝中可抑制禾谷鐮刀菌、雪腐鐮刀菌等有害菌的生長，同時，在白地霉生長過程中分泌的多種水解酶對大麥胚乳細胞的溶解具有促進作用［6］。本研究以甘啤3號大麥為原料，以甘肅省輕工研究院食品發酵室篩選的白地霉菌株作為生物制麥添加物，通過響應面法進行優化實驗，建立連續變量曲面模型［7］，擬研究最佳制麥工藝，以提高甘啤3號大麥綜合品質，改進傳統制麥工藝，提高企業經濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮淺色甘啤3號大麥，貯存于4℃冰箱中備用;菌株為本實驗室篩選得到的白地霉GQG28菌株;甘氨酸標準品 上海中國惠興生化試劑有限公司，分析純;Na2HPO4·12H2O、KH2PO4·2H2O、氫氧化鈉、CH3COONa·3H2O、冰醋酸、硫酸、硫代硫酸鈉、百里酚酞、淀粉、碘均為分析純。

恒溫鼔風干燥箱 上海一恒科技有限公司;pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;電子天平 奧豪斯國際貿易有限公司;DLFU盤式粉碎機 濰坊魯本機械科技有限公司;小型浸麥槽 萊州銀星進出口有限公司;7200型分光光度計 上海合利儀器有限公司;恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫療儀器廠;糖化器 北京卓川電子科技有限公司;PB203－N分析天平 Metler－Toledo公司;培養箱 上海精密儀器儀表公司;顯微鏡 上海光學儀器廠;高壓滅菌鍋 上海茸研儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白地霉菌種的活化復壯 白地霉菌株4℃低溫冷藏，使用前，連續兩次轉接到PDA培養基培養進行活化，轉接到5°P麥芽汁平板上，30℃培養12h，挑取菌種加入25mL 5°P麥芽汁培養基中，于28℃，150r/min 下培養 48h［2］。

1.2.2 生物制麥工藝流程

1.2.2.1 浸麥(42h) 投料后水洗和浸麥6h，每隔2h通風20min，添加白地霉菌株。斷水10h，每隔1～2h通風20min。水浸2h，通風攪拌20min，斷水6h，每隔1～2h 通風20min。水浸 2h，通風20min。斷水 6h，每隔1h通風20min。水浸2h，通風20min。斷水6h，每隔 1h 通風20min。空休 2h 出槽［8］。

1.2.2.2 發芽(96h) 采用升溫發芽，總計96h，依次為 14℃，24h;16℃，24h;18℃，24h;20℃，24h;濕度控制:95%;通風:早、中、晚各通風一次，每次 15min［9］。

1.2.2.3 干燥(22h) 45℃ 5h，50℃ 6h，60℃ 6h，70℃ 2h，83℃ 3h［10］。

1.2.2.4 麥粉制備 細粉:經除雜的均勻麥芽樣品，經粉碎機(盤間距0.2mm)粉碎后得細粉。

粗粉:經除雜的均勻麥芽樣品，經粉碎機(盤間距 1.0mm)粉碎后得粗粉［11］。

1.2.3 分析方法 糖化力測定、α－氨基氮、浸出率測定:參見文獻［12］。

麥芽綜合指標計算:麥芽品質評價由糖化力，α－氨基氮和浸出物三個指標綜合衡量，糖化力是評價麥芽品質的重要指標，故綜合指標中糖化力權重占40%，α－氨基氮和浸出物權重分別占30%，即麥芽綜合指標=糖化力×40%+α－氨基氮×30%+浸出物×30%。

1.2.4 生物制麥單因素實驗 在其他因素不變的前提下，設定單因素的不同水平，對糖化力、α－氨基氮和浸出物進行測定，以綜合指標為結果進行單因素實驗，實驗設計如下:

1.2.4.1 白地霉接種量 浸麥第一段時，分別加入濃度為1 ×103、1 ×104、1 ×105、1 ×106、1 × 107、1 ×108個/g大麥的白地霉稀釋液，每組3個平行，根據麥芽綜合指標確定白地霉接種量。

1.2.4.2 浸麥溫度 浸麥溫度分別設置為12、15、18、21、24℃，每組3 個平行。

1.2.4.3 浸麥pH 分別用1mol/L NaOH和HCl溶液調節浸麥水 pH 為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，每組 3 個平行。

1.2.5 改造傳統制麥工藝響應面優化實驗 在單因素實驗基礎上，根據Box－Behnken原理，選擇白地霉接種量、浸麥溫度及浸麥pH三個因素為自變量，麥芽品質綜合指標為響應值，進行三因素三水平響應面實驗，因素水平見表1。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.6 產品真菌毒素檢測 黃曲霉毒素B1檢測:方法同 GB/T 18979［13］;赭曲霉毒素 A 檢測:方法同GB/T 23502［14］;脫氧雪腐鐮刀菌稀醇檢測:方法同GB/T 23503［15］;玉米赤霉烯酮檢測:方法同 GB/T 5009.209［16］。

1.2.7 數據處理 響應面分析采用Design－Expert8.0.6設計軟件。

2 結果與分析

2.1 白地霉菌種的活化復壯

白地霉菌種復壯結果見圖1，復壯后的菌種調整不同濃度用于實驗接種。

圖1 菌種復壯Fig.1 Strains rejuvenation

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 白地霉接種量對麥芽品質的影響 由圖2可知，隨著白地霉接種量的增加，麥芽的糖化力先增加，之后緩慢減少;α－氨基氮則先上升后下降，在1×108個/g大麥濃度時，有略微上升趨勢;浸出物呈輕微下降趨勢。麥芽綜合指標隨著白地霉接種量的增加先增大，在1×104個/g大麥濃度時，麥芽綜合指標達到最大值，之后呈下降趨勢。原因可能是當接種量為1×103個/g大麥時，所接白地霉菌種的數量相比大麥表面自然存在的微生物數量可以忽略，因此不能在大麥表面獲得生長優勢。當接種量大于1×104個/g大麥濃度時，微生物和麥芽之間，或者微生物彼此之間對氧氣競爭，造成大麥發芽過程中的供氧不足，發芽不充分，故綜合指標值降低［17］。

圖2 白地霉接種量對麥芽品質的影響Fig.2 Effect of Geotrichum candidum Link inoculation value on malt quality

2.2.2 浸麥溫度對麥芽品質的影響 由圖3可知，隨著浸麥溫度的增加，麥芽的糖化力和α－氨基氮先上升后緩慢下降，浸出物呈逐漸下降趨勢;麥芽綜合指標表現出先上升趨勢，當浸麥溫度增至15℃達到最大值，之后則下降。原因是當浸麥溫度過低時，抑制白地霉的生長代謝，而當溫度過高時，大麥發芽的均一性受到影響，所以綜合指標值呈現出先增大后減小的趨勢。

圖3 浸麥溫度對麥芽品質的影響Fig.3 Effect of soaking temperature on malt quality

2.2.3 浸麥pH對麥芽品質的影響 由圖4可知，隨著浸麥pH的增加，麥芽的糖化力先上升后下降，α－氨基氮表現出先上升后下降，在pH為8時，有略微上升趨勢;浸出物則逐漸下降。麥芽綜合指標隨著浸麥pH增大，開始上升，當增至4時達最大值，之后下降。可能是因為pH為3時，白地霉的生長代謝受到抑制。隨著pH逐漸增大，超過所接菌種的最適生長pH時，生長代謝再次被抑制，故表現出麥芽品質的綜合指標值降低。

圖4 浸麥pH對麥芽品質的影響Fig.4 Effect of soaking pH on malt quality

2.3 響應面結果與分析

2.3.1 響應面優化實驗結果 響應面實驗結果見表2。

表2 Box－Behnken實驗結果Table 2 Design and result of Box－Behnken experiment

2.3.2 方差分析 方差分析結果見表3，利用軟件對表2實驗結果進行二次多元回歸擬合，得到麥芽綜合指標對白地霉接種量、浸麥溫度以及浸麥pH的多元回歸方程:

Y=205.26+1.45A－1.36B－0.58C－1.54AB+0.16AC－0.21BC－39.64A2－8.32B2－23.52C2

對上述麥芽綜合指標進行方差分析，由表3可知，該方程顯著(p＜0.0001，失擬項 p=0.3275＞0.05)。其中，除了C(浸麥pH)、白地霉接種量和浸麥pH交互作用(AC)、浸麥溫度和浸麥pH交互作用(BC)對麥芽綜合指標結果影響不顯著(p＞0.05)外，其余項均對麥芽綜合指標結果影響極顯著。因此，各因素對麥芽綜合指標的影響不是簡單的線性關系。

表3 ANOVA分析結果Table 3 Results of ANOVA analysis

軟件分析的復相關系數R2為0.9995，校正后R2Adj為0.9988，測試值與預測值非常接近，表明方程擬合程度好。實驗所得結果與預測值之間的誤差較小，則可以用該模型進行生物制麥工藝的分析和預測［18］。

2.3.3 多因素交互作用響應曲面圖分析 三維曲面圖見圖5～圖7。

圖5 白地霉接種量和浸麥溫度對麥芽品質綜合指標交互影響的響應面圖Fig.5 Response surface for synthetical target of malt quality as a function of inoculation value and soaking temperature

圖6 白地霉接種量和浸麥pH對麥芽品質綜合指標交互影響的響應面圖Fig.6 Response surface for synthetical target of malt quality as a function of inoculation value and soaking pH

圖7 浸麥溫度和浸麥pH對麥芽品質綜合指標交互影響的響應面圖Fig.7 Response surface for synthetical target of malt quality as a function of soaking temperature and soaking pH

由圖5可以看出，在浸麥pH一定的條件下，隨著白地霉接種量和浸麥溫度的增加，麥芽品質的綜合指標先上升后下降。而隨著接種量增大，麥芽品質的綜合指標先快速升高后快速降低。由此可知適當的增加接種量和升高浸麥溫度可以提高麥芽的品質。而接種量對麥芽品質影響較大。圖中等高線呈橢圓形，表明接種量和浸麥溫度兩因素交互作用顯著。

由圖6可知，當浸麥溫度一定，白地霉接種量和浸麥pH同時變化時，隨著二者的增加，麥芽品質的綜合指標呈先增大后減小的趨勢。圖中等高線接近圓形，表明接種量和浸麥pH兩因素在一定范圍內交互作用很小。

由圖7和表3可知，當白地霉接種量一定時，浸麥溫度和浸麥pH間的交互作用不顯著。圖中隨著浸麥溫度的增加，麥芽品質的綜合指標變化程度小，先緩慢升高后逐漸降低，而隨著浸麥pH的增加，麥芽品質的綜合指標呈現先升高后下降的趨勢。

2.3.4 響應面法優化實驗結果與驗證實驗 為了獲得生物制麥工藝過程中白地霉接種量、浸麥溫度和浸麥pH 3個因素的最佳組合值，對數學回歸模型求一階偏導，得出其最優組合為:白地霉接種量10098.32個/g大麥，浸麥溫度14.75℃，浸麥pH3.99，此條件下麥芽品質理論綜合指標的預測值為205.33。

為了驗證模型的準確性，將生物制麥的最佳工藝條件修正為:白地霉接種量104個/g大麥，浸麥溫度15℃，浸麥pH4.0進行3次驗證實驗。結果表明，在此最優條件下，所制麥芽糖化力為308.5WK、α－氨基氮為186mg/100g、浸出物相對質量分數為87.1%，得出麥芽綜合指標為206.15，與理論預測值205.33較為接近，說明模型的擬合程度較好，回歸方程對生物制麥工藝進行分析和預測可靠，可以利用該工藝條件制備高品質麥芽。

2.4 產品真菌毒素檢測

產品中真菌毒素殘留量與《食品安全國家標準GB 2761－2011》中大麥真菌毒素限量對比結果見表4。

表4 產品與國家標準對比結果Table 4 Contrast of standards with products and National standards

2.5 產品與行業標準對比

產品指標與《中華人民共和國輕工行業標準QB/T1686－2008》指標對比結果見表5。

表5 產品與行業標準對比結果Table 5 Contrast of standards with products and light industry

由表5可以看出，生物制麥所得產品的糖化力、α－氨基氮、浸出物均高于行業標準中的優級產品，本研究利用微生物制麥可以得到品質較高的大麥產品。

3 結論

采用單因素對比分析與響應面結合的實驗方法，得到最優生物制麥工藝:白地霉接種量104個/g大麥，浸麥溫度15℃，浸麥pH為4.0的條件下，生物制麥的理論預測麥芽綜合指標值為205.33，所制備的麥芽綜合指標為 206.15，所制麥芽糖化力為308.5WK、α－氨基氮為186mg/100g、浸出物相對質量分數為87.1%。

與食品安全國家標準對比，本研究所得產品中未檢出真菌毒素，且產品標準均高于輕工業行業標準QB/T1686－2008中優級產品標準。

［1］白普一.中國啤酒大麥的現狀及思考［J］.中國食品工業，2008(2):20－21.

［2］喬洪升，蔡國林，孫軍勇，等.制麥白地霉的篩選及其初步應用［J］.食品與生物技術學報，2011，30(2):295－301.

［3］朱俊勤.微生物制麥技術研究進展［J］.釀酒科技，2005(1):11－14.

［4］Noots I，Derycke V，Michiles C，et al.Improvement of malt modification by Rhizopus Ⅶ as starter culture［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49(8):3718－3724.

［5］Boivin P，Malanda M，Dumoulin M.Improving the quality of malting barley by employing microbial starter cultures in the field［J］.Journal of the Institute of Brewing，1999，105(3):145－147.

［6］龍杰，孫軍勇，陸健.微生物對麥芽品質的影響［J］.啤酒科技，2007(1):87－89.

［7］楊玉紅，劉芳，康宗利，等.響應面法優化 Streptomyces albus B－215菌發酵產ε－PL的培養基成分［J］.中國釀造，2011(11):138－142.

［8］趙慶川，孫安忠.甘肅大麥制麥工藝探討［J］.啤酒科技，2005，5:41－42.

［9］朱俊勤.利用微生物技術提高國產麥芽質量的研究［D］.無錫:江南大學，2005.

［10］韓鵬.啤酒麥芽干燥工藝優化［D］.蘭州:甘肅農業大學，2009.

［11］劉輝.麥芽的質量要求及其標準［J］.啤酒科技，2000，10:10－15.

［12］張五九，康永璞，熊曉帆，等.QB/T l686－2008.中華人民共和國輕工行業標準:啤酒麥芽［S］.北京:中國輕工業出版社，2008.

［13］王晶，張鵬，張藝兵，等 .GB/T 18979－2003.中華人民共和國國家標準:食品中黃曲霉毒素的測定［S］.北京:中國標準出版社，2003.

［14］吳如軍，鮑蕾，張輝珍，等 .GB/T 23502－2009.中華人民共和國國家標準:食品中赭曲霉毒素A的測定［S］.北京:中國標準出版社，2009.

［15］張輝珍，王曉濱，單連菊，等 .GB/T 23503－2009.中華人民共和國國家標準:食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定［S］.北京:中國標準出版社，2009.

［16］隋凱，李鳳琴，李軍，等 .GB/T 5009.209－2008.中華人民共和國國家標準:谷物中玉米赤霉烯酮的測定［S］.北京:中國標準出版社，2008.

［17］龍杰.利用白地霉提高低發芽率大麥溶解性能的研究［D］.無錫:江南大學，2008.

［18］張倩，張曉峰，韓萍，等.響應面法優化小麥胚酸奶工藝的研究［J］.中國釀造，2011，6:125－128.