響應面法優化羅非魚魚皮膠原多肽螯合鎂的工藝條件的研究

崔 瀟，江虹銳，*，劉小玲，林 瑩，肖碧紅，白 洋

(1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530000;2.百洋水產集團有限公司，廣西南寧530000;3.廣東百維生物科技有限公司，廣東化州525100)

羅非魚又稱非洲鯽魚，屬鱸形目、麗魚科，是我國主要的淡水經濟魚種。目前我國羅非魚出口呈逐年上升趨勢，產品主要是凍魚片和凍全魚兩大類，在加工過程中產生的魚皮、魚骨、魚頭等下腳料高達原料的60%以上，不僅形成極大的浪費還造成了環境污染［1］。因此，充分利用羅非魚下腳料資源，采用現代生物技術方法對羅非魚下腳料資源進行再加工，提高其經濟價值勢在必行。近年來，人們開始關注從水產類下腳料中獲得的膠原肽的活性以及與金屬螯合的研究。如霍健聰等研究了帶魚下腳料制備多肽鐵螯合物［2］。張俊敏等研究了鱈魚皮膠原蛋白鋅肽螯合物的制備［3］。陸劍鋒等研究了斑點叉尾回魚魚骨膠原蛋白螯合鈣的制備［4］。許慶陵等研究了羅非魚魚肉與鋅的螯合條件［5］。但是，關于鎂(Mg)與膠原肽的螯合工藝研究未見報道。鎂(Mg)是人體內能量代謝和許多酶促反應的激活劑，低Mg可使機體細胞溶血脆性升高導致人體新陳代謝紊亂［6］，包括血壓升高、胰島素分泌障礙、血脂代謝障礙及引發相關的代謝綜合癥。攝入充足的Mg制劑可以對這些代謝紊亂癥起到預防和改善的作用［7］。探討鎂離子與膠原多肽螯合反應最佳工藝條件，旨在為羅非魚下腳料的深加工提供新途徑，同時為鎂補充劑提供一種新的來源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚魚皮膠原多肽 廣西百洋水產集團股份有限公司提供，分子量≤3000u;氯化鎂(MgCl2)，分析純 成都市科隆化學試劑廠;EDTA二鈉鹽，分析純 西隴化工股份有限公司;絡黑T，分析純 天津科密歐試劑有限公司。

pH5J－3F實驗室pH計 上海佑科儀器儀表有限公司;GSY－Ⅱ電熱恒溫水浴鍋 北京醫療設備廠;臺式低速自動離心機 長沙平凡儀器公司;FA電子分析天平 上海精科儀器;傅里葉變換紅外光譜儀(FTID Spectrometer) 天津港東科技發展股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 螯合反應工藝流程 魚皮膠原多肽→溫水溶解(60℃)→加入MgCl2→調節溫度→調節pH→鰲合反應→加入乙醇洗滌→離心(5000r/min)→取沉淀→純化→烘干→多肽鎂鰲合物。

1.2.2 響應面優化魚皮膠原多肽鎂離子螯合反應的工藝條件 膠原多肽與鎂離子螯合反應過程中，以螯合率為評價指標，以膠原蛋白多肽與MgCl2的質量比(實驗時固定膠原蛋白多肽的質量為恒量，改變鎂離子的質量)、反應體系的pH、溫度和時間為影響因素設計螯合反應單因素實驗，根據單因素實驗結果，質量比、pH、溫度對螯合體系反應的影響較大，而當反應時間大于30min對螯合體系無影響。因此，設計以螯合率為響應值，以膠原蛋白肽:MgCl2的質量比、pH、反應溫度為影響因素的三因素三水平17個試驗點的響應面分析實驗，因素水平編碼見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3 螯合率的測定 采用EDTA絡合法對膠原蛋白肽Mg螯合反應進行評價［8］。

螯合率(%)=螯合態Mg的含量/Mg的總量×100=CV1/CV0×100

式中:C為 EDTA二鈉鹽標準溶液的濃度，mol/L;V1為滴定螯合態Mg的含量所消耗的EDTA二鈉鹽溶液體積，mL;V0為滴定Mg的總量所消耗的EDTA二鈉鹽溶液體積，mL。

1.2.4 傅里葉紅外光譜分析 取已經制備好的羅非魚魚皮膠原多肽鎂的螯合物約2mg放入瑪瑙研缽中，與200mg左右干燥的光譜純級KBr混合并研磨均勻。將研磨后的混合物制成壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀，采用漫光反射模式測定在4000～400cm－1區間吸收光譜，分析特征峰。

1.2.5 數據分析 所有實驗均進行3次平行實驗，利用Design Expert8.05b軟件對響應面實驗數據分析處理，探究影響相應值的最關鍵因素，并找出制備羅非魚魚皮膠原多肽鎂螯合物的最優條件。p＜0.05為差異性顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗對羅非魚魚皮多肽鎂螯合率的影響

2.1.1 質量比對螯合率的影響 固定膠原多肽與Mg離子螯合反應過程中體系溫度為70℃，pH7.0，反應時間30min，以膠原多肽:MgCl2的質量比為變量探究質量比對多肽鎂螯合率的影響，結果如圖1所示。螯合率隨著質量比的增加而增大，當質量比為1∶5時螯合率達到最大值，當繼續增大質量比螯合率開始下降。螯合反應體系的質量比是影響多肽與金屬離子發生螯合反應的一個重要因素，質量比太小時，膠原多肽與Mg離子很難形成環狀穩定配合物［9］，質量比過大，螯合反應后剩余的膠原多肽增多，造成了原料的浪費。因此，膠原多肽:MgCl2的質量比設定為1∶5。

圖1 質量比對螯合率的影響Fig.1 Effect of Collagen Petide/Mg2+weight ratio on ability of chelation

2.1.2 pH對螯合率的影響 固定膠原多肽與Mg離子螯合反應過程中體系溫度為70℃，質量比為1∶5，時間30min，改變體系pH，探究不同pH對螯合率的影響，結果如圖2所示。pH對螯合率的影響很大，隨著pH的升高螯合率逐漸增大，當pH7.0時螯合率達到最大值，繼續增大pH螯合率明顯下降。pH過小時，體系中含有大量H+，H+會與Mg2+爭奪供電基團，不利于螯合物的形成，當pH過大時，鎂離子形成氫氧化物沉淀，也會影響螯合物的形成［10］。因此，膠原多肽與Mg離子螯合反應，體系pH7.0時為宜。

圖2 pH對螯合率的影響Fig.2 Effect of pH on ability of chelation

2.1.3 溫度對螯合率的影響 固定膠原多肽與Mg離子螯合反應過程中體系質量比為1∶5，pH7.0，時間30min，探究不同溫度對螯合率的影響，結果如圖3所示。隨著溫度的升高，螯合率明顯增加，當溫度達到70℃時，螯合率達到最大值，再升高溫度，螯合率開始快速下降。這是由于螯合反應是一個放熱反應，溫度過高不利于螯合反應的進行［4］。因此，膠原多肽與Mg離子螯合反應，體系溫度控制在70℃時為宜。

圖3 溫度對螯合率的影響Fig.3 Effect of temperature on ability of chelation

2.1.4 時間對螯合率的影響 固定膠原多肽與Mg離子螯合反應過程中體系質量比為1∶5，pH7.0，溫度70℃。以反應時間為變量，探究時間對螯合率的影響，結果如圖4所示。在30min內，螯合率隨時間的延長逐漸上升，當T=30min時，螯合率達到最大值，繼續延長反應時間對螯合率影響不大。一般的金屬離子配位反應是室溫下的快速反應。大多數的金屬離子在溶液中可以發生快速反應，其半衰期僅為毫秒到微妙之間［11］。因此，實驗將膠原多肽與鎂離子螯合反應時間設定為30min。

圖4 時間對螯合率的影響Fig.4 Effect of time on ability of chelation

2.2 響應面優化實驗

2.2.1 響應面分析方案與實驗結果 根據表1因素水平編碼表選擇質量比、pH、溫度為自變量，分別記為X1、X2、X3，并以螯合率為響應值Y，設計響應面實驗，實驗方案及結果見表2。實驗結果經過Design Expert8.05b軟件處理，得到響應面二次回歸方程:Y=84.48+1.46X1－0.49X2+0.88X3－1.60X1X2+0.36X1X3+3.96X2X3－6.96X12－3.23X22－5.92X32。

表2 響應面實驗方案及實驗結果表Table 2 The response surface experiment schemes and experiment results

響應面實驗中，質量比、溫度、pH對膠原肽與Mg離子螯合反應影響的方差分析，見表3。表中直觀的反映出這三個因素對螯合率影響的顯著性，依次為質量比＞溫度＞pH。質量比和溫度直接影響螯合率的大小，而pH對螯合率的影響相對較小。響應面實驗中復合相關系數R2=0.94640，R2adj=0.91430說明該模型與實驗擬合程度好;在p＜0.05為差異性顯著的條件下，失擬項不顯著;回歸方程顯著。建立的回歸方程模型符合實際情況，回歸方程有效。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 The results of Regression model of variance analysis

2.2.3 響應曲面圖型分析與優化 魚皮膠原多肽與鎂離子的響應曲面圖見圖5～圖7。圖5～圖7非常直觀的反映出各個因素對響應值的影響，曲面圖形的形狀可以反映出影響因素的顯著性。圖形的形狀近似圓形說明各個因素之間的交互作用不很顯著。經過Design Expert8.05b對數據處理得出的最優條件是:質量比為 1∶5.12，pH6.93，溫度為 70.53℃，響應面模型預測的螯合率為84.315%。

根據實驗室的實際情況及方案實施的可操作性將最優方案工藝參數修正為質量比為1∶5，pH為7.0，溫度為70℃，以此條件進行三次平行試驗測得的螯合率為84.580%，與預測值相比誤差為0.265%。因而，說明通過響應曲面法預測得到的優化工藝參數準確可靠具有實用價值。在相關研究中，羅非魚下腳料蛋白多肽在最優條件下與鋅的螯合率為87.56%［12］。帶魚蛋白水解液在最適條件下與亞鐵離子的螯合率為93.000%［13］。因此，本實驗所得的螯合工藝條件比較合理。

圖5 質量比和pH對魚皮膠原蛋白多肽鎂螯合物的響應面圖Fig.5 Quality ratio and pH on the response surface of fish skin collagen peptides chelating magnesium

圖6 質量比和溫度對魚皮膠原蛋白多肽鎂螯合物的響應面圖Fig.6 Quality ratio and temperature on the response surface of fish skin collagen peptides chelating magnesium

圖7 溫度和pH對魚皮膠原蛋白多肽鎂螯合物的響應面圖Fig.7 Temperature and pH of the response surface of fish skin collagen peptides chelating magnesium figure

2.3 魚皮膠原多肽及魚皮膠原多肽鎂螯合物的紅外光譜分析研究

膠原蛋白溶液中存在氨基酸殘基之間的酰胺鍵，還有少量的氨基和羧基。通過紅外光譜分析，膠原多肽的圖譜中會出現氨基(－NH2)和羧基(C=O)的吸收峰，膠原多肽與鎂離子螯合后，使吸收峰發生改變或者偏移［14］。

膠原蛋白與膠原蛋白螯合鎂的紅外光譜如圖8(a，b)所示，圖8a為魚皮膠原多肽的紅外光譜圖，8b為魚皮膠原多肽鎂螯合物的紅外光譜圖。圖8a中3411.51cm－1是－NH2的吸收峰，是由N－H的伸縮振動引起;1646.94cm－1屬于酰胺Ⅰ帶，是由C=O的伸縮振動引起［15］;1162.89cm－1是NH3+的變角振動吸收峰。622.89cm－1處則是由N－H面外變形振動引起［16］。圖8b加入Mg離子后，3411.51cm－1氨基的伸縮振動吸收峰出現偏移，向高波位移動，且吸收峰變弱，622.89cm－1處吸收峰向高波數移動，吸收峰變弱，表明Mg2+與氨基有結合［17］。酰胺Ⅰ帶吸收峰1646.94－1cm－1向高波移動且鰲合前后出現強弱變化，推測羧基可能也以共價建的方式與鎂離子結合。1162.89cm－1處的NH2吸收峰向低波位發生了偏移，且吸收峰變弱，推測Mg2+與－NH2之間存在的結合用。

圖8 膠原多肽和膠原多肽螯合鎂的FT－IR光譜圖Fig.8 FT－IR spectrogram of collagen and petide chelate magnesium

3 結論

本實驗在單因素實驗結果的基礎上，運用響應面優化實驗的方法，確定了羅非魚魚皮膠原蛋白多肽螯合鎂的最佳工藝條件為:質量比1∶5、溫度70℃、pH7.0、時間30min，螯合率達到84.580%。其中各因素對螯合率影響大小的順序是質量比＞溫度＞pH。并且通過紅外光譜實驗證明了膠原多肽鎂螯合物的存在。

［1］秦剛，王庭.羅非魚下腳料魚糜系列功能性產品的研發［J］.肉類研究，2010，137(7):78－81.

［2］霍健聰，鄧尚貴，謝超.帶魚下腳料蛋白多肽鐵螯合物的制備及抗氧化活性研究［J］.食品工業科技，2009，30(4):267－270.

［3］張俊敏，樂輝，陳忻，等.響應面法優化微波固相合成鱈魚皮膠原蛋白鋅肽螯合物的工藝［J］.廣東農業科學，2011，(22):87－90.

［4］陸劍鋒，孟昌偉，李進，等.斑點叉尾鮰魚骨膠原多肽螯合鈣的制備及其特征［J］.水產學報，2012，36(2):314－319.

［5］許慶陵，曾慶祝，閆磊，等.羅非魚肽－鋅配合物的制備及其生物活性［J］.食品科學，2010，31(10):75－80.

［6］黃曉鈺，劉鄰渭.食品化學綜合實驗［M］.北京:中國農業大學出版社，2002:131－132.

［7］Gums JG.Magnesium in cardiovascular and other disorders［J］.Am J Health Syst Pharm，2004，61(15):1569－1576.

［8］程春萍，張麗娜.連續滴定法測定蛋殼中鈣、鎂離子的含量［J］.內蒙古石油化工，2010(8):35－36.

［9］楊姍姍.羅非魚皮多肽鋅螯合鹽的制備及性質研究［M］.南昌:南昌大學，2008.

［10］ Wedekind K J A E Hortin，DH Baker.Methodology forassessing Zinc bioavailability efficacy estimates for Zinc－2 methionihe，Zinc Sulfate，and Zinc Oxide［J］.J A nim Sci，1992，70:178－187.

［11］巴索洛，皮爾遜.無機反應原理－溶液重金屬絡合物的研究［M］.1987，5.

［12］李彤剛，洪鵬志，楊萍，等.二次回歸正交旋轉組合優化羅非魚下腳料超濾酶解液螯合鋅的工藝條件［J］.食品工業科技，2013，34(2):234－237.

［13］鐘明杰.帶魚下腳料蛋白水解螯合物制備及生物特性研究［D］.青島:中國海洋大學，2009.

［14］付文雯，馬美湖，蔡朝霞.牛骨蛋白酶解制取肽鈣的研究進展［J］.食品與發酵科技，2009，45(1):1－5.

［15］張曉霞，劉剩取，李國英.堿法水解黑魚魚鱗及制備多肽螯合鈣工藝的研究［J］.食品科技，2010，35(12):130－134.

［16］孫勝玲，王愛勤，高憶慈，等.D－氨基葡萄糖與鋅鹽配位的紅外光譜研究［J］.光譜學與光譜分析，2005，25(3):374－376.

［17］E P Paschalis，O Jacenko，B Olsen，et al.Fourier transform infrared microspectroscopic analysis identifies alterations in mineral properties in bones from mice transgenic for type X collagen［J］.Bone，1996，2(19):151－156.