“一測(cè)多評(píng)”測(cè)定木香中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量

夏麗珍，李春嬌，賴增發(fā)

（1.三明市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，福建 三明 365001；2.三明市藥品檢驗(yàn)所，福建 三明 365000）

木香為菊科植物木香Aucklandia lappa Decne.的干燥根，其中木香烴內(nèi)酯（costunolide）和去氫木香內(nèi)酯（dehydrocostuslactone）為揮發(fā)油的主要成分，此外還有菊糖和木香堿等。木香主要起行氣調(diào)經(jīng)止痛功效，是治脾胃虛寒氣滯要藥［1］。木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯均為倍半萜內(nèi)酯，性質(zhì)不穩(wěn)定，不易保存［2］。《中華人民共和國(guó)藥典》（2010 版）一部中用外標(biāo)對(duì)照法測(cè)木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯香總量［3］。為更好控制其質(zhì)量，節(jié)約對(duì)照品，提高檢測(cè)效率，本實(shí)驗(yàn)以相對(duì)易得的木香烴內(nèi)酯為內(nèi)標(biāo)，采用一測(cè)多評(píng)法［4］（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMA）建立去氫木香內(nèi)酯的含量測(cè)定方法，并將一測(cè)多評(píng)方法與常規(guī)外標(biāo)法進(jìn)行比較，獲得滿意結(jié)果。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀；島津LC-2010A高效液相色譜儀；Ultimate XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Gemini C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Agilent Tc-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Waters sunfire C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；BP211D電子天平（德國(guó)塞多利斯股份公司）；KQ5200DE數(shù)控超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料 木香烴內(nèi)酯（111524－201107）、去氫木香內(nèi)酯（111525－201008）對(duì)照品均購自中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度100%；甲醇為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純，木香樣品為市售品（北京同仁堂股份有限公司）。

2 方法學(xué)考察

2.1 色譜條件 色譜柱為Ultimate XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（65∶35）；柱溫 25℃；流速：1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng) 225 nm。上述色譜條件下，各組分分離度良好，見圖1、圖2。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取木香烴內(nèi)酯對(duì)照品12.68 mg、去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品16.32 mg，分別置50 mL量瓶中，各加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量。再分別精密吸取上述各對(duì)照品儲(chǔ)備液8 mL置同一25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液（木香烴內(nèi)酯 81.15 μg／mL，去氫木香內(nèi)酯 104.4 μg／mL）。

2.3 供試品溶液的制備 取木香（批號(hào)201208562，過四號(hào)篩）粉末約0.1 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min（功率300 W，頻率50 kHz），取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系 精密移取混合對(duì)照品溶液2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25 mL 置 50 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，分別精密取20 μL注入液相色譜儀，以進(jìn)樣量對(duì)峰面積積分值進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：木香烴內(nèi)酯 Y＝2179.4X＋4.6448（r＝0.9997）， 去氫木香內(nèi)酯 Y＝874.1X＋0.6751（r＝0.9998），表明木香烴內(nèi)酯在 0.0811～0.811 μg、去氫木香內(nèi)酯在0.104～1.044 μg線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰，計(jì)算木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.56%、0.43%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取木香（批號(hào)201208562，過四號(hào)篩）粉末約0.1 g，精密稱定，制備供試品溶液，分別于制備后 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣 10 μL， 記錄色譜峰，計(jì)算得木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.16%、0.63%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取木香（批號(hào)201208562，過四號(hào)篩）粉末約0.1 g，共6份，精密稱定，分別制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰面積并計(jì)算含量及RSD。結(jié)果供試品中木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含量分別為1.5833%、2.5294%，RSD分別為1.3%、1.8%。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 取木香（批號(hào)201208562，過四號(hào)篩）粉末0.05 g，共6份，分別加入木香烴內(nèi)酯對(duì)照品儲(chǔ)備液3 mL、去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品儲(chǔ)備液4 mL，制備供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算得木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯平均加樣回收率分別為98.36%、98.64%，RSD分別為1.5%、1.8%。

3 方 法

3.1 色譜柱考察 取“2.4”項(xiàng)下制備的6個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，以木香烴內(nèi)酯為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算木香烴內(nèi)酯對(duì)去氫木香內(nèi)酯的校正因子，考察Ultimate XB-C18柱、Gemini C18柱、Agilent Tc-C18柱、Waters sunfire C18柱4種色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表1。表明不同色譜柱所得到的相對(duì)校正因子基本一致。

表1 不同色譜柱的相對(duì)校正因子

3.2 高效液相色譜考察 取“2.4”項(xiàng)下制備的6個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，以木香烴內(nèi)酯為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算木香烴內(nèi)酯對(duì)去氫木香內(nèi)酯的校正因子，考察了島津LC-2010A和Agilent 1200這2種高效液相色譜儀對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表2。表明在不同的液相色譜系統(tǒng)下所得到的相對(duì)校正因子基本一致。

表2 不同高效液相色譜的相對(duì)校正因子

3.3 色譜峰專屬性考察 利用相對(duì)保留值r＝tR1／tR2進(jìn)行定位，即以待測(cè)組分色譜峰與木香烴內(nèi)酯色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間來確定，去氫木香內(nèi)酯與木香烴內(nèi)酯峰相對(duì)保留時(shí)間的平均值為1.1452，RSD為1.7%。結(jié)果見表3。

表3 2種成分的保留時(shí)間及相對(duì)保留時(shí)間

4 樣品測(cè)定

分別取各批樣品制備供試品溶液，分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定。分別采用外標(biāo)法和“一測(cè)多評(píng)”法計(jì)算木香中木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的含量，結(jié)果見表4。表明一測(cè)多評(píng)法可用于木香中木香內(nèi)酯的含量測(cè)定。

表4 木香中木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的測(cè)定

5 討 論

在一定的線性范圍內(nèi)，成分的量與檢測(cè)器響應(yīng)值成正比，即：W＝f（A）。測(cè)定時(shí)，以木香中木香烴內(nèi)酯為內(nèi)標(biāo)，建立其與去氫木香內(nèi)酯之間的相對(duì)校正因子（relative correction factor，RCF），然后通過校正因子計(jì)算其含量。計(jì)算公式為：Wm＝fkm×（Wk×Am）／Ak，Ak為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Wk為內(nèi)標(biāo)物的濃度，Am為其它組分m峰面積，Wm為其它組分m的濃度。一測(cè)多評(píng)法適用于對(duì)照品難得或制備成本高或不穩(wěn)定的情況下同類多組分的同時(shí)測(cè)定［5］。

木香中2個(gè)主要成分木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量都很高［6］，這也是建立含量指標(biāo)測(cè)定的主要原因。用流動(dòng)相甲醇-水（65∶35），分離效果明顯，可以使木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯與其它組分分離（分離度＞1.5）。選用甲醇、乙醇不同提取溶劑，結(jié)果顯示甲醇作溶劑采用超聲30 min，目標(biāo)成分提取效率高［7］。因2個(gè)內(nèi)酯成分的熱不穩(wěn)定性，故未考察回流和索氏提取等熱提取方式。

參考內(nèi)標(biāo)峰的保留時(shí)間，再根據(jù)紫外吸收特征判斷，即能夠正確判斷出目標(biāo)峰的準(zhǔn)確位置。結(jié)果表明：利用上述方法進(jìn)行峰的定位是可行的。

本實(shí)驗(yàn)考察不同品牌的色譜柱和液相系統(tǒng)對(duì)木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯之間相對(duì)校正因子的影響，說明實(shí)驗(yàn)中得到的校正因子具有較高的可信度，通過計(jì)算可知“一測(cè)多評(píng)”法與外標(biāo)法測(cè)到的含量沒顯著性差異，“一測(cè)多評(píng)”法可以在對(duì)照品缺省的情況下實(shí)現(xiàn)定量測(cè)定的要求。

［1］雷載權(quán)，陳松育，高學(xué)敏，等.中藥學(xué)［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1995：161.

［2］劉俊紅，李棣華，伍孝先.提取木香中木香烴內(nèi)酯及去氫木香內(nèi)酯影響因素的初步研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（12）：3013-3014.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：57-58.

［4］王智民，高慧敏，付雪濤，等.一測(cè)多評(píng)法中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式方法學(xué)研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2006，31（23）：1925-1928.

［5］王智民，錢忠直，張啟偉，等.一測(cè)多評(píng)法建立的技術(shù)指南［J］.中國(guó)中藥雜志，2011，36（6）：657-658.

［6］趙小民，殷高彬.不同產(chǎn)地木香中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的 HPLC 測(cè)定［J］.安微醫(yī)藥，2009，13（6）：617-618.

［7］李慧，陳寶田，翁立冬，等.木香炮制品中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的 HPLC 測(cè)定［J］.中草藥，2007（11）：1659-1661.