白花蛇舌草揮發(fā)油對人肝癌細胞HepG2增殖的抑制作用

王麗麗 ，林 婧 ，蔡巧燕 ，詹友知 ，陳達鑫 ，彭 軍

（1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州350122）

原發(fā)性肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌）是最常見的原發(fā)性肝腫瘤，發(fā)病率居全球惡性腫瘤的第5位，病死率居第3位［1］。白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd，HDW）的全草，其主要化學成分有熊果酸、免疫多糖、烏索酸、白花蛇舌草素等，具有增強免疫活性、抗氧化和抗腫瘤活性，現(xiàn)廣泛用于治療各種炎癥和腫瘤［2-6］。白花蛇舌草揮發(fā)油主要成分為十六酸，亞油酸，9-十八碳烯酸，龍腦，6，10，14-三甲基-2-十五烷酮，4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等［7-8］。目前國內(nèi)外均未見其抗腫瘤活性的相關(guān)報道。本文對白花蛇舌草揮發(fā)油對肝癌HepG2細胞活性進行了研究，為其臨床應用提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 材料與細胞株 白花蛇舌草購自福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂；肝癌HepG2細胞細胞株均購自上海中科院細胞庫。

1.2 試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購自Hyclone公司；MTT購自Sigma公司。

1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（Heal Force），ELX800酶標儀（BioTek），IX70熒光倒置相差顯微鏡（Olympus）。

2 方 法

2.1 白花蛇舌草揮發(fā)油的制備 取白花蛇舌草樣品200 g，粉碎成粗粉，過40目篩，稱量200 g，加入2 000 mL水，浸泡10 h，按《中華人民共和國藥典》2005年版附錄揮發(fā)油測定法，回流提取6 h，采用乙醚做吸收溶劑，乙醚用量為5 mL，得揮發(fā)性成分乙醚提取液，加入無水硫酸鈉，得無水揮發(fā)油（0.09%），得到的油用DMSO超聲溶解，配置成200 mg／mL溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞培養(yǎng) HepG2細胞經(jīng)含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基（含 100 U／mL青霉素和 100 μg／mL鏈霉素）培養(yǎng)，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱進行傳代培養(yǎng)。

2.3 MTT法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期細胞，進行細胞計數(shù)，HepG2以4×105個／mL接種于96孔板中，接種體積為 100 μL／孔，置 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，至細胞貼壁，且覆蓋率達60%時，分別加入62.5、125、250、500、1 000 μg／mL 的白花蛇舌草揮發(fā)油，24 h后吸取各孔溶液，每孔加入100 μL的0.5 mg／mL MTT 溶液，37℃培養(yǎng) 4 h。4 h后，小心吸去孔內(nèi)液體。往每孔內(nèi)加入100 μL DMSO，振蕩10 min后，在570 nm處測OD值。計算細胞活力，方程如下：

細胞活力（%）＝［實驗組A值／對照組A值］×100%。

2.4 細胞形態(tài)學觀察 人肝癌細胞HepG2經(jīng)不同濃度的白花蛇舌草揮發(fā)油提取物干預24 h后，置于倒置顯微鏡下觀察，并拍照。

2.5 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)應用Excel 2003和DPS v6.55軟件進行分析處理，實驗數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 白花蛇舌草揮發(fā)油提取物對HepG2細胞活力的影響 白花蛇舌草揮發(fā)油提取物對肝癌HepG2細胞生長存在明顯的抑制作用，并且隨濃度的加大而增大，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。IC50值為 369.3 μg／mL，結(jié)果見圖 1。

圖1 白花蛇舌草揮發(fā)油提取物對HepG2細胞活力的影響

3.2 白花蛇舌草揮發(fā)油提取物對HepG2細胞形態(tài)的影響 在倒置顯微鏡下觀察可以看出：對照組的HepG2細胞生長良好，主要以近圓形和梭型2種形態(tài)存在，核仁清晰，胞質(zhì)均勻，細胞舒展拉伸。而隨著給藥劑量的增加，懸浮的死細胞數(shù)量增多，貼壁細胞數(shù)量則顯著下降，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，胞質(zhì)、核仁逐漸固縮，細胞體積變小，變圓，在顯微鏡下可看到胞內(nèi)空泡變多。結(jié)果表明：白花蛇舌草揮發(fā)油對人肝癌細胞HepG2的生長有明顯的抑制作用且呈現(xiàn)顯著的劑量依賴性，見圖2。

圖2 白花蛇舌草揮發(fā)油對HepG2細胞形態(tài)的影響（200×）

4 討 論

肝癌與胃癌、肺癌等其它實體瘤有明顯的不同，肝功能惡化和肝硬化的合并癥一直是肝癌患者的主要死因之一。因此，在肝癌的治療過程中，必須保護肝功能和機體的免疫機制［9］，但是目前的抗腫瘤藥物的毒副作用大而且容易產(chǎn)生耐藥性，因而治療效果不理想。天然中藥具有療效廣泛，毒副作用相對較小，作用效果明顯等優(yōu)勢［10-12］。揮發(fā)油成分多是小分子物質(zhì)，能被機體快速吸收，作用廣泛，且多具芳香開竅、引藥上行的功用，在心腦血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)、抗菌、抗炎、抗癌、抗病毒、促進藥物吸收等多方面都具有功效。

白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草的全草，具有增強免疫活性、抗氧化和抗腫瘤活性，現(xiàn)廣泛用于治療各種炎癥和腫瘤［13－14］。其揮發(fā)油主要成分為十六酸，亞油酸，9-十八碳烯酸，龍腦，6，10，14-三甲基-2-十五烷酮，4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等。本研究采用白花蛇舌草的揮發(fā)油，探討其對人肝癌HepG2細胞的影響。研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草揮發(fā)油干預后，人肝癌HepG2細胞密度明顯減少，細胞變小，且對HepG2細胞的細胞活力也有顯著的抑制作用，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，表明白花蛇舌草揮發(fā)油對人肝癌HepG2細胞有明顯的抑制作用。

［1］SIEGEL R，NAISHADHAM D，JEMAL A.Cancer statistics，2013［J］.CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11-30.

［2］葉榕，林久茂，魏麗慧，等.白花蛇舌草乙醇提取物對人結(jié)腸癌HT-29細胞增殖及Hedgehog信號傳導通路表達的影響［J］.海峽科學，2012，6（8）：100-102.

［3］魏麗慧，林久茂，彭軍，等.白花蛇舌草乙醇提取物對人結(jié)腸癌細胞HT-29 Pim-1和Pim-2 mRNA表達的影響［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，6（4）：284-287.

［4］CAI Q Y，LIN J M，WEI L H，et al.Hedyotis Diffusa Willd inhibits colorectal cancer growth in vivo via inhibition of STAT3 signaling pathway［J］.International Journal of Molecular Sciences，2012，13（5）：6117-6128.

［5］LIN J M，CHEN Y Q，WEI L H，et al.Hedyotis Diffusa Willd extract induces apoptosis via activation of the mitochondrion-dependent pathway in human colon carcinoma cells［J］.Int J Oncol，2010，37（5）：1331-1338.

［6］彭軍，林久茂，魏麗慧.白花蛇舌草提取物對結(jié)腸癌HT-29細胞bcl-2和bax表達的影響［J］.福建中醫(yī)學院學報，2010，20（5）：23-26.

［7］劉志剛，羅佳波，陳飛龍.不同產(chǎn)地白花蛇舌草揮發(fā)性成分初步研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2005，16（2）：132-134.

［8］王麗，周誠，麥惠珍.白花蛇舌草及水線草揮發(fā)性成分分析［J］.中藥材，2003，26（8）：563-564.

［9］王昌俊.中藥介入治療原發(fā)性肝癌現(xiàn)狀與展望［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2002，9（9）：84-88.

［10］LEE M Y，LIN H Y，CHENG F，et al.Isolation and characterization of new lactam compounds that inhibit lung and colon cancer cells from adlay（Coix lachryma-jobi L.var.ma-yuen Stapf）bran［J］.Food and Chemical Toxicology，2008，46（6）：1933-1939.

［11］CHEN H H，CHIANG W C，CHANG Y Y，et al.Kuo.Antimutagenic constituents of adlay（Coix lachryma-jobi L.var.ma-yuen Stapf） with potential cancer chemopreventive activity［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（12）：6444-6452.

［12］LI S C，CHEN C M，LIN S H，et al.Effects of adlay bran and its ethanolic extract and residue on preneoplastic lesions of the colon in rats［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2011，91（3）：547-552.

［13］朱立俏.白花蛇舌草的化學成分和抗腫瘤活性的研究進展［J］.化工時刊，2012，26（10）：37-41.

［14］孫巖，李潔.白花蛇舌草抗腫瘤作用的研究進展［J］.食品與藥品，2012，14（5）：210-213.