慢病毒介導的人PLK1 RNA干擾對食管鱗癌細胞裸鼠移植瘤的抑制作用及機制

劉曉影，陳麗梅，張寶剛，馮衛國，王守訓，杜長青，劉順梅，趙春玲

PLK1(polo-like kinase 1)是一種高度保守的哺乳動物細胞的絲氨酸/蘇氨酸激酶。PLK1在細胞有絲分裂的不同時期都起到十分重要的作用［1－3］。近年來的研究發現，在大多數人類腫瘤中PLK1均表現為高表達，而且PLK1的過高表達在結直腸癌、直腸癌、非肌肉浸潤性膀胱癌患者均提示預后不良［4－7］，提示 PLK1 有可能成為惡性腫瘤治療的新靶點。已有研究表明PLK1與食管鱗癌的發生發展有一定的關系［8－9］，我們前期研究表明 PLK1 在鱗狀食管癌組織中呈高表達，且PLK1的表達程度與食管鱗癌的分化程度及淋巴結轉移密切相關［10］，但PLK1影響腫瘤發生發展的機制尚不明確。本研究利用RNA干擾技術降低食管鱗癌細胞中PLK1基因的表達，探討PLK1的RNA干擾對食管鱗癌細胞惡性生長的影響及其相關機制，為進一步研究PLK1在食管鱗癌發生發展中的作用及以PLK1為靶點的食管鱗癌基因治療的可行性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI 1640培養基、胰酶和 FBS購自Gibco公司;食管鱗癌細胞TE-8購自中國科學院上海細胞庫;LV-NC和LV-PLK1重組慢病毒為本實驗室制備(重組慢病毒載體的構建及具體序列已發表 );RNAiso Plus、PrimeScript?RT reagent Kit、SYBR?PrimeScript?RT-PCR Kit均購自 TaKaRa公司。RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自Beyotime公司。兔抗人PLK1單抗、兔抗人β-actin單抗和HRP標記的羊抗兔二抗、鼠抗人CD31和Caspase-3抗體、生物素化二抗、HRP標記的三抗均購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 食管鱗癌細胞TE-8的培養及慢病毒感染RPMI 1640培養基(含10%FBS)培養食管鱗癌細胞TE-8(簡稱TE-8)。在細胞培養瓶(75 cm2)中，接種1×106個食管鱗癌細胞，加入病毒上清稀釋液(10 MOI)混勻后放入CO2培養箱(37℃，5%CO2)，24 h后移去病毒上清稀釋液，加入RPMI 1640培養基(10%FBS)，繼續培養24 h后用于實驗。

1.2.2 熒光定量 PCR檢測食管鱗癌細胞株中PLK1基因在mRNA水平的表達 利用RNAiso Plus和PrimeScript?RT reagent Kit從體外培養的食管鱗癌細胞株中提取總RNA，并反轉錄為cDNA。利用SYBR?PrimeScript?RT-PCR Kit進行熒光定量PCR檢測，具體步驟參考試劑盒說明書。反應條件為:94℃ 2 min;94℃ 30 s，60℃ 15 s，72℃ 15 s，30 個循環;72℃ 10 min。本研究所用引物由賽百勝公司合成。PLK1上游引物:5'-TGACGAGTTCTTTACTTCTGGC-3'，下游引物:5'-CAGGCTGTCACCATCATTGTAG-3'，退火溫度是60℃，擴增片斷長度是451 bp;內參 β-actin上游引物:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下 游 引 物:5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，退火溫度是55℃，擴增片斷長度是206 bp。

1.2.3 Western blot檢測食管鱗癌細胞株中 PLK1基因在蛋白質水平的表達 取對數生長期的食管鱗癌細胞株，利用RIPA細胞裂解液試劑盒進行蛋白質樣品制備，并參照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書對蛋白質進行定量。每孔上樣30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳后利用半干法轉膜，將凝膠中的蛋白質轉移到 PVDF膜上，封閉后分別加入一抗(兔抗人PLK1單抗1∶1 000稀釋;兔抗人 actin單抗1∶2 000稀釋)和 HRP標記的羊抗兔二抗(1∶2 000稀釋)，洗滌后，與 ECL試劑反應處理曝光，對蛋白質條帶進行分析。

1.2.4 裸鼠皮下移植瘤模型實驗檢測食管鱗癌細胞的體內惡性生長能力 選取5～8周的裸鼠10只，分成2組。消化對數生長期的TE-8，再用無血清無抗生素的培養液洗細胞2次，并配成1×107個細胞/100 μl的細胞懸液。將制備好的細胞懸液接種于裸鼠皮下(接種量約為100 μl/只)。常規飼養裸鼠，皮下移植瘤的體積達到6 mm×6 mm時開始通過皮下注射的方式進行分組治療。實驗治療組每次每只裸鼠注射2×106TU的LV-PLK1重組慢病毒;對照組注射與實驗治療組相同劑量的LV-NC重組慢病毒。每3 d治療1次，共治療10次。治療完畢將裸鼠處死，取出瘤體，觀察測量瘤體的體積，分組統計，拍照。

1.2.5 裸鼠皮下移植瘤組織Caspase-3和CD31免疫組化的檢測 采用免疫組化SABC法對Caspase-3和CD31進行免疫組化檢測。主要步驟為:處死裸鼠后，取出腫瘤，標本用4%多聚甲醛固定，常規脫水透明、浸蠟、石蠟包埋，切成厚4 μm的連續切片，經常規脫蠟至水，50 ml·L－1H2O2去除內源性過氧化物酶活性，抗原修復后50 ml·L－1羊血清封閉非特異結合蛋白，滴加1∶50稀釋的一抗(鼠抗人Caspase-3，鼠抗人 CD31)，4℃孵育過夜;生物素化二抗、HRP標記的三抗室溫孵育各1 h，加DAB顯色，經蘇木素復染、脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果并拍照。以細胞深染成顆粒狀棕黃色為陽性表達。

1.2.6 新生血管密度(MVD)的計算 CD31免疫組化染色陽性顯示為新生微血管密度，其判定方法:CD31染色的組織標本中觀察到由內皮細胞或幼稚內皮細胞形成的管狀、窄隙狀、囊狀和空泡狀染成黃褐色的結構即判定為可計數的微血管。400倍光鏡下計數全部橫切和縱切的微血管數作為MVD計數。

2 結果

2.1 慢病毒介導的PLK1基因沉默 RNA干擾能明顯抑制食管鱗癌細胞中PLK1的表達。介導PLK1基因RNA干擾的重組慢病毒(LV-PLK1)和對PLK1基因表達無影響的對照組慢病毒(LV-NC)分別感染食管鱗癌細胞，72 h后利用熒光定量PCR和Western blot分別在mRNA水平和蛋白質水平上檢測PLK1的表達量。結果如Fig 1所示，LV-PLK1在mRNA水平上產生明顯的干擾效應，與LV-NC組相比，其干擾效率約為73%(Fig 1B)。Western blot檢測結果顯示，在蛋白質水平上PLK1的表達同樣低于陰性對照組，β-actin作為內參(Fig 1A)。實驗結果表明，重組慢病毒(LV-PLK1)能明顯抑制食管鱗癌細胞中PLK1的表達。

Fig 1 Detection of PLK1 interference efficiency

2.2 靶向干擾PLK1基因表達的慢病毒抑制食管鱗癌體內的生長 給予種植移植瘤的裸鼠注射LVPLK1進行治療，結果顯示，LV-PLK1治療組的移植瘤瘤體大小明顯比對照組(注射同劑量LV-NC)小。測量瘤體體積并對數據進行分析，LV-PLK1治療組與對照組的差異具有統計學意義(P＜0.01)，結果如Fig 2所示。該結果表明，靶向PLK1的基因沉默能明顯抑制裸鼠體內移植瘤的生長。

Fig 2 Effects of lentiviral vector mediated RNAinterference targeting human PLK1 gene on transplantedesophageal squamous cell carcinoma in nude mice

2.3 靶向干擾PLK1基因表達的慢病毒誘導體內食管鱗癌細胞的凋亡 Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能，活化的Caspase-3能夠導致細胞凋亡。在裸鼠皮下移植瘤中，Caspase-3免疫組化染色結果顯示:Caspase-3陽性染色位于胞質中，被深染成顆粒狀棕黃色，LV-PLK1治療組的裸鼠皮下移植瘤中Caspase-3染色強度明顯高于對照組(LV-NC)，結果如Fig 3所示。因此，PLK1基因被RNA干擾后誘導的食管鱗癌細胞的凋亡在移植瘤的生長抑制中也起重要作用。

Fig 3 Expression of Caspase-3 in the transplanted tumor tissue of esophageal squamous cell carcinoma in nude mice

2.4 靶向干擾PLK1基因表達的慢病毒能抑制食管鱗癌微血管生成 CD31可以標染血管內皮細胞，染色位于內皮細胞表面。在免疫組化中，CD31主要用于證明內皮細胞組織的存在，用于評估腫瘤血管生成。對裸鼠皮下移植瘤進行CD31免疫組化染色，如Fig 4所示，可以觀察到不規則的微血管網(呈棕黃色)。LV-PLK1治療組MVD數目比對照組(LV-NC)明顯減少(P＜0.01)，如Tab 1所示。這表明PLK1在食管鱗癌的微血管生成調控中起重要作用。裸鼠體內移植瘤的生長抑制除了與PLK1基因被RNA干擾后能直接抑制細胞增殖有關外，食管鱗癌的血管生成抑制也起了重要作用。

Fig 4 Expression of CD31 in the transplanted tumor tissue of esophageal squamous cell carcinoma in nude mice

Tab 1 Statistical results of new microvessel density(MVD)in subcutaneous transplanted tumor in nude mice±s，n=5)

Tab 1 Statistical results of new microvessel density(MVD)in subcutaneous transplanted tumor in nude mice±s，n=5)

＊＊P＜0.01 vs LV-NC

Group MVD LV-NC 112.67 ±4.3 LV-PLK1 24.78 ±3.1＊＊

3 討論

作為調控細胞周期正常進行、中心體成熟的重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶，PLK1于1994年由瑞士實驗腫瘤研究所的Golsteyn等［11］最先報道。近年來的研究表明，在大多數人類腫瘤中PLK1均表現為高表達［4－7］，PLK1能否成為腫瘤治療的靶點也成為新的研究熱點。RNA干擾技術［12］的出現為我們提供了新的基因功能研究與基因治療手段。研究發現:在原位膀胱癌模型中應用雙靶向 survivin和PLK1的RNA干擾進行膀胱內滴注，能明顯減少瘤體體積［13］。Xu 等［14］的研究表明，靶向 PLK1 的RNA干擾能明顯抑制結直腸癌的體內外生長。Sp?nkuch-Schmitt等［15］在 2002 年 就 發 現，靶 向PLK1的RNA干擾能誘導腫瘤細胞的凋亡。

為了研究PLK1在食管鱗癌發生發展中的作用及PLK1能否作為食管鱗癌潛在的治療靶點，我們前期研究結果表明，通過PLK1 siRNA瞬時轉染，靶向PLK1的RNA干擾能明顯抑制食管鱗癌細胞的體外惡性增殖。盡管所用食管鱗癌細胞系不同，我們的結果與Bu等［8］的體外研究結果一致。為了進一步客觀地在動物整體水平評價PLK1對食管鱗癌發生發展的作用及作為治療靶點的可行性，我們又通過建立的裸鼠皮下移植瘤模型，應用本實驗室構建的靶向PLK1的RNA干擾的重組慢病毒載體進行皮下注射治療，結果表明靶向沉默PLK1基因的表達能明顯抑制裸鼠體內移植瘤的生長。

Caspase-3免疫組化染色顯示體內移植瘤細胞凋亡的結果表明:靶向PLK1的RNA干擾裸鼠體內移植瘤的生長抑制，除了與PLK1基因被RNA干擾后能直接抑制細胞增殖有關外，PLK1的低表達通過誘導Caspase-3的表達，從而引起食管鱗癌細胞的凋亡在移植瘤的生長抑制中也起了重要作用。PLK1如何影響食管鱗癌細胞中Caspase-3的表達，目前尚未見研究報道，需要做深入的研究。

通過CD31免疫組化染色顯示新生血管密度，發現靶向PLK1的RNA干擾抑制了食管鱗癌的血管生成，這表明PLK1在食管鱗癌的血管生成調控中起到一定的作用。目前，已有研究表明血管生成是包括食管癌在內的實體腫瘤生長和轉移的必要因素［16］，但PLK1與腫瘤血管生成的關系目前尚無研究報道。影響腫瘤血管生成最關鍵的調節因素為:血管生成因子與抑制因子的平衡狀態。失平衡將促使腫瘤從無血管期轉化為血管期，新生血管形成，腫瘤體積迅速增大，這一過程被稱為“血管生成開關機制(angiogenic switch)”［17］，食管鱗癌的血管生成也是如此［18－19］。PLK1可能通過調控血管生成因子或抑制因子的表達，促進食管鱗癌血管的生成，從而推動了其惡性發展，這將是我們今后研究的一個主要方向。

總之，靶向人PLK1的RNA干擾能有效抑制食管鱗癌細胞體內外的生長，下調的PLK1可能通過調控Caspase-3的表達而誘導食管鱗癌細胞凋亡，通過抑制食管鱗癌的血管生成而抑制了食管鱗癌的惡性進展。PLK1有可能是治療食管鱗癌的一個新靶點。

［1］ 董憲喆，張 鵬，畢明剛.絲/蘇氨酸激酶PLK1研究進展［J］.中國藥理學通報，2010，26(3):289 －93.

［1］ Dong X Z，Zhang P，Bi M G.Research progress on serine/threonine kinase PLK1［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(3):289－93.

［2］ Schmit T L，Nihal M，Ndiaye M，et al.Numb regulates stability and localization of the mitotic kinase PLK1 and is required for transit through mitosis［J］.Cancer Res，2012，72(15):3864 －72.

［3］ Zhang L，Shao H，Huang Y，et al.PLK1 phosphorylates mitotic centromere－associated kinesin and promotes its depolymerase activity［J］.J Biol Chem，2011，286(4):3033－46.

［4］ Takahashi T，Sano B，Nagata T，et al.Polo-like kinase 1(PLK1)is overexpressed in primary colorectal cancers［J］.Cancer Sci，2003，94(2):148 －52.

［5］ Han D P，Zhu Q L，Cui J T，et al.Polo-like kinase 1 is overexpressed in colorectal cancer and participates in the migration and invasion of colorectal cancer cells［J］.Med Sci Monit，2012，18(6):BR237－46.

［6］ R?del F，Keppner S，Capalbo G，et al.Polo-like kinase 1 as predictive marker and therapeutic target for radiotherapy in rectal cancer［J］.Am J Pathol，2010，177(2):918 －29.

［7］ Fristrup N，Ulh?i B P，Birkenkamp-Demtr?der K，et al.Cathepsin E，maspin，Plk1，and survivin are promising prognostic protein markers for progression in non-muscle invasive bladder cancer［J］.Am J Pathol，2012，180(5):1824 －34.

［8］ Bu Y，Yang Z，Li Q，et al.Silencing of polo-like kinase(Plk)1 via siRNA causes inhibition of growth and induction of apoptosis in human esophageal cancer cells［J］.Oncology，2008，74(3 －4):198－206.

［9］ Feng Y B，Lin D C，Shi Z Z，et al.Overexpression of PLK1 is associated with poor survival by inhibiting apoptosis via enhancement of survivin level in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Int J Cancer，2009，124(3):578 －88.

［10］ Zhao C，Gong L，Li W，et al.Overexpression of Plk1 promotes malignant progress in human esophageal squamous cell carcinoma［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2010，136(1):9 －16.

［11］ Golsteyn R M，Schultz S J，Bartek J，et al.Cell cycle analysis and chromosomal localization of human Plk1，a putative homologue of the mitotic kinases Drosophila polo and Saccharomyces cerevisiae Cdc5［J］.J Cell Sci，1994，107(Pt 6):1509 － 17.

［12］ Tan F L，Yin J Q.Application of RNAi to cancer research and therapy［J］.Front Biosci，2005，10:1946 － 60.

［13］ Seth S，Matsui Y，Fosnaugh K，et al.RNAi-based therapeutics targeting survivin and PLK1 for treatment of bladder cancer［J］.Mol Ther，2011，19(5):928 －35.

［14］ Xu W J，Zhang S，Yang Y，et al.Efficient inhibition of human colorectal carcinoma growth by RNA interference targeting pololike kinase 1 in vitro and in vivo［J］.Cancer Biother Radiopharm，2011，26(4):427－36.

［15］ Sp?nkuch-Schmitt B，Bereiter-Hahn J，Kaufmann M，et al.Effect of RNA silencing of polo-like kinase-1(PLK1)on apoptosis and spindle formation in human cancer cells［J］.Natl Cancer Inst，2002，94(24):1863－77.

［16］ Kubota Y，Kaneko K，Konishi K，et al.The onset of angiogenesis in a multistep process of esophageal squamous cell carcinoma［J］.Front Biosci，2009，14:3872 －8.

［17］ Jain R K.Normalization of tumor vasculature:an emerging concept in antiangiogenic therapy［J］.Science，2005，307(5706):58－62.

［18］ Kitadai Y，Onogawa S，Kuwai T，et al.Angiogenic switch occurs during the precancerous stage of human esophageal squamous cell carcinoma［J］.Oncol Rep，2004，11(2):315 －9.

［19］ Li Z，Shimada Y，Uchida S，et al.TGF-alpha as well as VEGF，PD-ECGF and bFGF contribute to angiogenesis of esophageal squamous cell carcinoma［J］.Int J Oncol，2000，17(3):453 －60.