內質網應激在四氯化碳致急性肝損傷中的作用

陶 莉，陳 熙，張 程，何 薇，任曉非，許建明，徐德祥

肝臟暴露于各種有害因素可引起急性肝損傷，長期作用可導致損傷不能完全修復，發生代償性修復的結果，即形成肝纖維化，并可進一步發展成肝硬化甚至肝癌，嚴重危害機體健康［1］。目前認為肝纖維化形成機制主要是由于肝臟在急性損傷后引起炎性反應，長期刺激激活肝臟星形細胞轉化成肝臟成纖維細胞，膠原合成增加，形成肝纖維化［2］，但前期急性肝損傷的發生機制尚未完全闡明。四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)是一種公認的肝毒物，其引起的化學性肝損傷動物模型常用于研究急、慢性肝損傷分子機制［3］。

內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是機體對外來刺激產生的應激性反應，當外來因素引起機體功能紊亂時，內質網內出現未折疊或錯誤折疊蛋白的聚集和鈣平衡紊亂，誘發ERS發生。ERS可以降低胞內未折疊蛋白的濃度并阻止其凝集而發揮保護作用，但如刺激過強或過久，這些反應不足以恢復和維持內質網穩態，就會發生細胞和組織的損傷。近年來的研究發現，ERS在細胞死亡、炎癥反應、脂質蓄積及氧化應激過程中發揮重要作用［4-6］。已有研究證實，CCl4致急性肝損傷過程中存在肝臟細胞凋亡、壞死、炎癥反應和氧化應激等效應［7］。本文擬探討ERS在CCl4致小鼠急性肝損傷中的作用及部分機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 CCl4購于汕頭市西隴化工廠有限公司(批號:0811152);丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號:20121103);抗小鼠的GRP78多克隆抗體購于Cell Signal公司(批號:3177);p-JNK(批號:6254)和CHOP多克隆抗體(批號:2895)均購于Santa Cruz公司;Caspase-12多克隆抗體購于Millipore公司(批號:3612);p-IRE1α多克隆抗體(批號:16927)和ECL試劑盒(批號:174573)均購于Thermo Fisher Scientific公司;TUNEL試劑盒購于Promega公司(批號:0000011851);SP免疫組化試劑盒購于北京中山金橋生物公司(批號:13152);DAB購于Sigma公司;其他試劑均購于Sigma公司。

1.2 動物分組與給藥 ♂ ICR小鼠(6-8周齡，28-30 g，清潔級)購于安徽醫科大學實驗動物中心。實驗前，在自由飲食、飲水，維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜節律，溫度20℃ -25℃，相對濕度(50±5)%的環境下適應性喂養1周，各組小鼠均自由進食標準飼料。24只♂ICR小鼠隨機分為CCl4處理不同時點組(0、2、6、12、24 和 72 h)，每組 4 只。所有小鼠在剖殺前均禁食12 h。小鼠經腹腔注射給予 10%CCl4(300 μl·kg-1)，在腹腔注射 CCl4后不同時點(0、2、6、12、24 和 72 h)分別采集血液。處死后迅速取出肝臟組織，稱重，分別取約0.5 cm×0.5 cm大小組織置于4%多聚甲醛溶液中，制備石蠟切片，其余肝臟組織置于-80℃冰箱保存待用。

1.3 血清肝生化指標檢測 用ALT試劑盒測定血清ALT活性。

1.4 HE染色法觀察肝組織病理學變化 肝臟組織置于4%多聚甲醛固定液中固定12-24 h后，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、脫蠟、梯度乙醇水化、常規HE染色和光學樹脂封片，光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理學改變并拍照。

1.5 TUNEL技術檢測肝組織凋亡 肝臟組織切片厚度5 μm，常規脫蠟至水化，用40 mg·L-1蛋白酶K進行細胞通透;后經平衡液濕盒平衡10 min;加TUNEL反應混合液(rTdT:生物素標記的dUTP:平衡液=1∶1∶98)進行標記反應，37℃恒溫烤箱中孵育90 min;再加 SSC溶液終止反應，以0.3%H2O2溶液進行封閉，接著加HRP標記的鏈霉親和素孵育30 min，用DAB法顯色，經復染、脫水、透明、封片。用光學顯微鏡(×100)觀察凋亡發生情況并計數。

1.6 免疫組織化學法檢測肝組織GRP78的分布肝臟組織切片厚度 5 μm，常規脫蠟至水化，用0.3%H2O2進行細胞通透和封閉內源性過氧化物酶;放入0.01 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中，微波修復抗原;用5%的羊血清來封閉非特異性蛋白，37℃恒溫箱，30 min;GRP78一抗孵育，37℃恒溫烤箱中30 min，再置4℃冰箱過夜;二抗孵育，37℃恒溫烤箱中30 min;再進行SP反應，DAB顯色，經復染、脫水、透明、封片。用光學顯微鏡(×100)觀察GRP78組織分布情況并拍照。

1.7 Western blot技術檢測ERS信號分子 取肝臟組織制備勻漿，上清定量和變性，變性蛋白樣品經SDS-PAGE電泳后轉移到PVDF膜，分別用GRP78、p-IRE1α、p-JNK、CHOP 及 Caspase-12抗體孵育3 h，DPBST浸洗液浸洗4次(每次10 min)，用DPBS洗1次(7 min)，用羊抗鼠IgG二抗孵育2 h，DPBST浸洗液浸洗4次(每次10 min)，用 DPBS洗1次(7 min)，用ECL發光液孵育5 min后壓X線片，顯影和定影。運用Image-Pro Plus5.0圖像分析軟件測定各蛋白條帶的灰度值。

2 結果

2.1 CCl4引起急性肝損傷 與對照組(0 h)相比，CCl4處理組小鼠肝重、肝臟系數和ALT水平均明顯升高(Tab 1，P＜0.01)。進一步觀察發現，經CCl4處理24 h后肝臟ALT升高最為明顯(Tab 1，P＜0.01)。HE染色結果顯示，與對照組相比，經CCl4處理后不同時點(2、6、12、24和72 h)肝細胞出現不同程度的壞死，壞死程度隨CCl4處理時間延長而逐漸加重，在24 h最為明顯，之后逐漸減弱，呈明顯的時間效應關系(Fig 1)。

2.2 CCl4引起肝細胞凋亡 TUNEL技術檢測CCl4引起的肝臟細胞凋亡。實驗結果顯示，經CCl4不同時點(2、6、12、24 和 72 h)處理后，僅在 24 h 出現大量的凋亡細胞(Fig 2)。

2.3 CCl4對肝細胞中ERS標志蛋白表達的影響

免疫組織化學結果顯示，經CCl4處理后不同時點(2、6、12、24 和 72 h)，小鼠肝臟出現不同程度的GRP78分布，GRP78的表達隨著作用時間增加而逐漸增強，在24 h分布最廣，24 h之后逐漸減弱(Fig 3)。Westernblot檢測結果顯示，CCl4處理后，GRP78、p-IRE1α、p-JNK、CHOP等ERS標志蛋白的表達隨著CCl4作用時間的延長而明顯增加，p-IRE1α在2 h即開始升高，GRP78在6 h明顯升高，下游信號因子p-JNK和CHOP于24 h升高最明顯，后逐漸減弱(Fig 4)。

Tab 1Effects of CCl4on the physiologic and serum parameters±s，n=4)

Tab 1Effects of CCl4on the physiologic and serum parameters±s，n=4)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Control 0 h CCl 4 2 h 6 h 12 h 24 h 72 h Body weight/g 30.3±1.3 29.9±0.3 28.4±0.2 30.4±0.2 29.4±2.0 28.5±1.4 Live weight/g 1.35±0.08 1.39±0.06 1.40±0.06 1.65±0.11＊＊ 1.63±0.09＊＊ 1.79±0.13＊＊Liver to body weight ratio/% 0.044±0.00 0.046±0.00 0.049±0.00＊＊ 0.054±0.00＊＊ 0.056±0.00＊＊ 0.063±0.00＊＊ALT/U·L-1 8.25±3.53 19.38±8.12* 64.17±19.91＊＊840.24±527.63＊＊13 066.67±1 074.60＊＊ 40.36±20.12＊＊

Fig 1 Effects of CCl4on pathomorphology ofhepatic histology determined by HE staining(×100)

Fig 2 Effects of CCl4on hepatic apoptosisdetermined by TUNEL(×100)

Fig 3 Effects of CCl4on distribution of GRP78 in hepatichistology determined by immunohistochemical staining(×100)

2.4 CCl4對肝細胞中促凋亡因子蛋白水平的影響

在 CCl4處理后不同時點(2、6、12、24 和 72 h)，肝臟促凋亡因子Caspase-12裂解水平隨CCl4作用時間增加而逐漸增強，至24 h最強，至72 h逐漸減弱(Fig 5)。

3 討論

本研究結果發現，CCl4處理組小鼠肝臟重量和肝臟臟器系數明顯增加，并伴有血清ALT水平明顯升高;HE染色發現肝臟出現明顯的組織充血、細胞水腫及局灶性壞死。TUNEL檢測結果顯示，肝臟在CCl4處理后24 h發生明顯的肝細胞凋亡，與Shi等［8］報道的研究結果相一致。近年研究證實，肝臟細胞凋亡在肝臟損傷中起重要作用［9-10］;進一步觀察發現，瘦素通過抗凋亡和抗氧化作用保護CCl4引起的急性肝損傷，提示肝細胞凋亡與急性肝損傷程度具有直接關系［11］。

越來越多的研究證實，ERS在細胞凋亡過程中起重要作用［12-14］。目前已知 ERS條件下，雙鏈RNA活化蛋白激酶樣內質網激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)通路、活性轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)通路和肌醇需要蛋白1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)通路被激活［12］。葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein78，GRP78)是發生 ERS的效應標志分子，與3條通路的激活密切相關［15］。近年來的研究顯示，肝臟ERS發生時，3條信號通路均可被激活。其中，PERK和IRE1α磷酸化可分別激活其下游分子CHOP和JNK，繼而誘發肝臟細胞凋亡，在急性肝損傷中起重要作用［13，16］。此外，ERS發生時可直接激活Caspase-12，不依賴經典的死亡受體或線粒體介導的細胞凋亡通路，引起細胞凋亡［17］。本實驗結果表明，給予小鼠CCl4處理后，肝細胞ERS效應標志分子GRP78蛋白水平明顯上調，肝臟p-IRE1α、p-JNK及CHOP等ERS標志蛋白明顯升高，裂解型Caspase-12蛋白水平也明顯增加，提示CCl4引起小鼠急性肝損傷過程發生ERS。本研究發現，肝細胞凋亡發生在CCl4處理后24 h，明顯滯后于ERS和Caspase-12激活的發生(2h開始即逐漸增強)，表明ERS在肝細胞凋亡中可能發揮重要作用。

Fig 4 Effects of CCl4on expression levels of GRP78，p-JNK，p-IRE1α and CHOP

Fig 5 Effects of CCl4on expression levels of cleaved Caspase-12

綜上所述，急性CCl4處理明顯升高小鼠肝臟GRP78、p-IRE1α和 p-JNK蛋白水平，上調肝臟CHOP蛋白表達，提示急性CCl4處理誘發小鼠肝臟ERS。基于急性CCl4處理導致肝臟細胞凋亡相關蛋白Caspase-12裂解，表明ERS可能參與肝細胞凋亡發生過程，并在急性肝損傷中可能發揮重要作用。本研究結果為今后進一步研究預防和治療急性肝損傷提供新的藥物作用靶點。

［1］ Friedman S L.Evolving challenges in hepatic fibrosis［J］.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2010，7(8):425-36.

［2］ Hernandez-Gea V，Friedman S L.Pathogenesis of liver fibrosis［J］.Annu Rev Pathol，2011，6:425-56.

［3］ Weber L W，Boll M，Stampfl A.Hepatotoxicity and mechanism of action of haloalkanes:carbon tetrachloride as a toxicological model［J］.Crit Rev Toxicol，2003，33(2):105-36.

［4］ Ji C，Kaplowitz N.Hyperhomocysteinemia，endoplasmic reticulum stress，and alcoholic liver injury［J］.World J Gastroenterol，2004，10(12):1699-708.

［5］ Joyce M A，Walters K A，Lamb S E，et al.HCV induces oxidative and ER stress，and sensitizes infected cells to apoptosis in SCID/Alb-uPA mice［J］.PLoSPathog， 2009， 5(2):e1000291.

［6］ Zheng Z，Zhang C，Zhang K.Measurement of ER stress response and inflammation in the mouse model of nonalcoholic fatty liver disease［J］.MethodsEnzymol，2011，489:329-48.

［7］ Bansal M B，Kovalovich K，Gupta R，et al.Interleukin-6 protects hepatocytes from CCl4-mediated necrosis and apoptosis in mice by reducing MMP-2 expression［J］.J Hepatol，2005，42(4):548-56.

［8］ Shi J，Aisaki K，Ikawa Y，et al.Evidence of hepatocyte apoptosis in rat liver after the administration of carbon tetrachloride［J］.Am J Pathol，1998，153(2):515-25.

［9］ Malhi H，Guicciardi M E，Gores G J.Hepatocyte death:a clear and present danger［J］.Physiol Rev，2010，90(3):1165-94.

［10］ Kim H Y，Park J，Lee K H，et al.Ferulic acid protects against carbon tetrachloride-induced liver injury in mice［J］.Toxicology，2011，282(3):104-11.

［11］ Serbet?i K，Uysal O，Erkasap N，et al.Anti-apoptotic and antioxidant effect of leptin on CCl4-induced acute liver injury in rats［J］.Mol Biol Rep，2012，39(2):1173-80.

［12］ Dara L，Ji C，Kaplowitz N.The contribution of endoplasmic reticulum stress to liver diseases［J］.Hepatology，2011，53(5):1752-63.

［13］ Malhi H，Kaufman R J.Endoplasmic reticulum stress in liver disease［J］.J Hepatol，2011，54(4):795-809.

［14］ Kim I，Xu W，Reed J C.Cell death and endoplasmic reticulum stress:disease relevance and therapeutic opportunities［J］.Nat Rev Drug Discov，2008，7(12):1013-30.

［15］ Lee A S.The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress［J］.Methods，2005，35(4):373-81.

［16］ Ji C，Mehrian-Shai R，Chan C，et al.Role of CHOP in hepatic apoptosis in the murine model of intragastric ethanol feeding［J］.Alcohol Clin Exp Res，2005，29(8):1496-503.

［17］ Sanges D，Marigo V.Cross-talk between two apoptotic pathways activated by endoplasmic reticulum stress:differential contribution of caspase-12 and AIF［J］.Apoptosis，2006，11(9):1629-41.