沉默PDE4B對內毒素刺激的小膠質細胞內cAMP的影響

和曉韻，底 妍，張利東，劉 健，劉清珍，李偉彥，嵇 晴

近年來有研究發現神經膠質細胞活化在神經病理性疼痛的發生、維持中發揮著重要作用［1－2］，磷酸二酯酶4(phosphodiesterase 4，PDE4)抑制劑能提高膠質細胞內的環磷腺苷(cyclic AMP，cAMP)水平，抑制細胞活化，減少炎性因子的產生［3－4］。PDE4存在4 種亞型(PDE4A、PDE4B、PDE4C 和 PDE4D)［5］，四種亞型在小膠質細胞內的分布、哪種亞型參與細胞內 cAMP的調節目前尚不清楚。本研究采用Western blot法觀察4種亞型在小膠質細胞的分布情況;采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術分別特異性沉默相應的PDE4亞型基因，觀察內毒素刺激前后小膠質細胞內cAMP的變化。

1 材料與方法

1.1 動物 新生SD大鼠(出生1～2 d)由南京軍區南京總醫院比較醫學科提供。

1.2 材料 DMEM高糖培養基、PBS緩沖液、谷氨酰胺溶液、胎牛血清(Gibco，美國);多聚賴氨酸、LPS(大腸桿菌011:B4)(Sigma，美國);大鼠 cAMP試劑盒(R＆D Systems，美國);Anti-PDE4A 抗體、Anti-PDE4B抗體和Anti-PDE4D抗體(Abcam，美國);Anti-PDE4C抗體(Fabgennix，美國);Anti-rabbit IgG，HRP-linked 抗體(Cell Signaling Technology，美國)。

1.3 原代小膠質細胞分離 采用Xue等［6］所述的小膠質細胞培養方法，并略加改進。新生SD大鼠無菌條件下開顱取腦并剔除腦膜、血管及海馬，取大腦皮層，預冷PBS緩沖液沖洗3遍后用1 ml槍頭吹打，離心(1 000 r·min－1，10 min)，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基制成細胞懸液，細胞計數后按每瓶2×1011·L－1濃度接種于多聚賴氨酸預先包被的75 cm2培養瓶(Corning，美國)，37℃，5%CO2培養箱培養。d2換全液，后按細胞生長情況，每隔2～3 d半量換液。培養9～10 d，可見星形膠質細胞鋪滿培養瓶底層，上層散在大量形狀不規則，透亮的小膠質細胞，密封瓶口，置于37℃恒溫水平搖床內，以160 r·min－1振蕩4 h，收集培養液，離心(1 200 r·min－1，10 min)，沉淀細胞加入DMEM培養基重懸并計數，按5×105/孔 密度將細胞接種于24孔板內，37℃培養箱內細胞黏附20 min，用PBS緩沖液清洗1次，最后加入含10%胎牛血清的高糖培養基37℃培養箱內孵育備用。

1.4PDE4A、PDE4B、PDE4C 和 PDE4D 蛋白表達水平測定 采用Western blot測定。細胞蛋白定量后，將總蛋白(50 μg)加入SDS上樣緩沖液，煮沸5 min使其變性，經SDS凝膠電泳，轉至PVDF膜，封閉液(5%脫脂牛奶)室溫封閉 1 h，分別加入PDE4A、PDE4B、PDE4C 和 PDE4D 一抗(1 ∶1 000，Anti-PDE4A 抗體;1∶1 000，Anti-PDE4B 抗體;1 ∶300，Anti-PDE4C 抗體;1 ∶500，Anti-PDE4D 抗體)4℃孵育過夜，TBST清洗5 min×6次，羊抗兔二抗(1∶1 000，Anti-rabbit IgG，HRP-linked 抗體)室溫孵育lh，TBST清洗5 min×6次，暗室內加顯色底物顯色曝光，掃描。內參為GAPDH(1∶1 000，anti-GADPH rabbit antibody，Cell Signaling Technology，美國)。

1.5 siRNA的制備 由Invitrogen公司合成實驗所需siRNA序列(Tab 1)，錯配siRNA為Blockit Alexa Fluor Red Oligo，載體為 LipofectaminTMRNAiMAX，以上所有序列均由Invitrogen公司合成。

Tab 1 Sequence of PDE4A-siRNA，PDE4B-siRNA，PDE4C-siRNA and PDE4D-siRNA in the expreiment

1.6 細胞分組與轉染 將培養細胞隨機分為空白對照組、LPS組、單純載體組、錯配 siRNA組、PDE4A-siRNA 組、PDE4B-siRNA 組、PDE4C-siRNA組和PDE4D-siRNA組。轉染前1 d將培養基更換為不含血清的高糖培養基。空白對照組和LPS組:細胞不進行轉染;單純載體組、錯配 siRNA組、PDE4A-siRNA 組、PDE4B-siRNA 組、PDE4C-siRNA組和PDE4D-siRNA組分別給予LipofectaminTMRNAiMAX 1 μl，錯配 siRNA、PDE4A siRNA、PDE4B siRNA、PDE4C siRNA 和 PDE4D siRNA 各 2 μl。轉染前所有siRNA分別與1 μl LipofectaminTMRNAiMAX在100 μl無血清培養基中混勻 (siRNA終濃度為20 nmol·L－1)，室溫放置15 min后逐滴加入細胞，每孔終體積為500 μl，置于培養箱中培養48 h。

1.7 PDE4A、PDE4B、PDE4C 和 PDE4D mRNA表達的測定 轉染48 h后，采用RT-PCR檢測PDE4A、PDE4B、PDE4C和 PDE4D mRNA的表達。按照RNA提取試劑盒［RNA isolation kit(Invitrogen)］的操作步驟進行總RNA提取，逆轉錄合成第1條cDNA。RT-PCR體系總反應量為20 μl，利用 Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen，USA)試劑盒在實時定量PCR擴增儀上按照程序進行實時 PCR(95℃ 2 min 變性，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環)。反應結束后確認擴增曲線和熔解曲線，分別計算各組 PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D mRNA的表達水平。

Tab 2 Primer sequence in the experiment

1.8 細胞內cAMP檢測 采用ELISA測定細胞內cAMP的含量。(1)細胞轉染48 h后，收集各組細胞;(2)轉染48 h后，更換培養基，除空白對照組外其余各組加入含有LPS(100 μg·L－1)的無血清培養基500 μl/孔，刺激30 min后收集各組細胞。按照ELISA試劑盒指示測定cAMP含量。

1.9 統計學分析 采用SPSS13.0軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示。PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D蛋白及mRNA表達水平，細胞內cAMP表達水平均采用單因素方差分析，其后組間兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結果

2.1 小膠質細胞內 PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D蛋白表達水平 采用Western blot法分別檢測小膠質細胞內4種亞型蛋白表達水平。如Fig 1所示，小膠質細胞表達PDE4 4種亞型蛋白。

2.2 轉染后小膠質細胞 PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D mRNA表達的變化 采用RT-PCR分別檢測轉染后各組的 PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D mRNA的表達，然后分別與空白對照組進行比較。如Fig 2A所示，與空白對照組相比，PDE4A-siRNA組PDE4A mRNA表達量明顯下降，抑制率為(63.4±5.2)%(P＜0.05)，其他各組 PDE4A mRNA表達量無明顯差異。PDE4B-siRNA組、PDE4C-siRNA組和PDE4D-siRNA組結果與PDE4A-siRNA組相似，抑制率分別為(65.3±6.4)%、(66.8±4.8)%、(72.5±7.0)%(Fig 2B、2C、2D，P ＜0.05)。

Fig 1 Protein expression of PDE4 subtypes in primary microglia assessed by Western blot Lane 1，2，3，4 represent four microglial cell samples.

2.3 LPS刺激前后小膠質細胞內cAMP表達的變化 如Fig 3所示，LPS刺激前，與空白對照組相比，轉染后的各組細胞內cAMP的含量無明顯變化(P＞0.05)。加入LPS刺激30 min后，與空白對照組相比各組細胞內cAMP的含量均明顯增高(P＜0.05)，但與LPS組相比，僅PDE4B-siRNA+LPS組細胞內的cAMP含量明顯升高(P＜0.05)，其余各組細胞內的cAMP含量差異無顯著性(P＞0.05)。

3 討論

活化的小膠質細胞介導的神經炎癥在多種疾病中發揮重要作用。提高細胞內cAMP水平可抑制小膠質細胞的活化，LPS為體外實驗中常用的小膠質細胞活化劑。既往有研究表明非特異性PDE4抑制劑可緩解神經病理性疼痛。因PDE4存在4種亞型，本研究采用Western blot法觀察4種亞型在小膠質細胞的分布情況，并采用RNAi技術沉默相應亞型的表達，觀察內毒素刺激前后小膠質細胞內cAMP變化。Western blot結果表明PDE4 4種亞型均在小膠質細胞內表達。

RNAi技術是利用雙鏈 RNA(double stranded RNA，dsRNA)高效、特異性阻斷體內特定基因表達，促使mRNA降解，使細胞表現出特定基因缺失表型的過程［7］。本研究根據基因文庫，分別設計了大鼠PDE4 4種亞型特異的siRNA序列，并采用脂質體包裹。RT-PCR結果顯示:PDE4A-siRNA、PDE4B-siRNA、PDE4C-siRNA及PDE4D-siRNA只能抑制相對應亞型的mRNA表達，對其它亞型無效，證明實驗選用的siRNA具有高效特異性。

Fig 2 Change of mRNA expression of PDE4A，PDE4B，PDE4C，PDE4D after transfection

Fig 3 Change of cAMP level before and after LPS stimulation

在測定細胞內cAMP含量的研究中，我們的結果表明無LPS刺激的靜息狀態下，抑制PDE4 4種亞型中的某一種并不能改變細胞內cAMP含量，可能是由于靜息狀態下4種亞型均參與cAMP的降解，單獨抑制某一種亞型不影響基礎cAMP水平。LPS刺激后，與空白對照組相比，細胞內cAMP水平反應性明顯增高，但與LPS組相比，僅PDE4B亞型抑制后cAMP明顯升高，而分別單獨抑制PDE4A，PDE4C和PDE4D 3種亞型后細胞內cAMP與LPS組差異無顯著性，說明LPS刺激對PDE4B亞型的影響遠大于其它3種亞型，LPS刺激狀態下，PDE4B可能在cAMP降解過程中發揮主要作用。

cAMP是廣泛存在于多種細胞的第二信使，cAMP主要通過其下游蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、環核苷酸操控離子通道(cyclic nucleotide-gated ion channels，CNG)以及環腺苷酸直接活化的交換蛋白(exchange proteins directly activated by cAMP，Epac)3條途徑調節細胞功能［8］。眾多的研究提示，激活小膠質細胞內cAMP通路能抑制絲裂原刺激的細胞活化，可能是通過PKA和Epac途徑［9－10］。

綜上所述，RNAi技術能有效抑制PDE4B 4種亞型mRNA的表達，在細胞功能上進一步證實了PDE4B siRNA能有效增加LPS刺激后小膠質細胞內cAMP的含量。PDE4B將成為治療慢性神經系統疾病的新靶點，至于在細胞水平及動物水平上PDE4B siRNA是否能有效減少炎性細胞因子的產生，從而達到治療慢性神經系統性病變，還有待進一步研究。

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