魷魚墨多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠腸道黏膜損傷的保護(hù)作用及初步機(jī)制研究

曹 露，左 濤，李學(xué)敏，于 卿，曹斌斌，王靜鳳，王玉明，薛長湖，唐慶娟

化療是目前世界上公認(rèn)的腫瘤三大治療方法之一，由化療引起的消化道不良反應(yīng)給患者造成了極大的痛苦［1］。環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)是目前臨床上常用的化療藥物，作用機(jī)制是能夠殺傷增殖迅速的組織細(xì)胞。但是，環(huán)磷酰胺在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)殺傷正常組織的細(xì)胞，特別是人體中生長旺盛的胃腸組織細(xì)胞，因而導(dǎo)致各種胃腸道不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、腹瀉等［2］。據(jù)報(bào)道，全世界每年有50萬患者受此癥干擾。尋找能夠預(yù)防化療藥物胃腸道不良反應(yīng)的生物活性物質(zhì)，對(duì)于提高腫瘤患者的生活質(zhì)量、保證化療效果具有重要意義。

魷魚墨是豐富易得的海洋生物資源。研究證實(shí)，魷魚墨主要由黑色素和富含巖藻糖的黏多糖組成［3］。大量的研究表明，魷魚墨汁具有止血［4］、抗凝血［5］、抗菌［6］、抗輻射［7］、抗氧化［8－9］、升高白細(xì)胞［10］等多種生理活性，是一種極具潛力的天然藥物資源。北太平洋魷魚(Ommastrephes bartrami)，屬真魷科，赤魷屬。其個(gè)體墨囊相對(duì)較大，是目前世界上主要捕撈和加工的魷魚品種。本課題組分離純化了北太平洋魷魚墨多糖，對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)及抗凝血活性進(jìn)行了研究;并且，在環(huán)磷酰胺腹腔注射構(gòu)建化療小鼠模型基礎(chǔ)上，證實(shí)該多糖具有提高化療小鼠腸道SIgA分泌的作用，提示其具有保護(hù)腸道黏膜的作用(論文另發(fā)表)。

本文擬深入研究北太平洋魷魚墨多糖對(duì)化療小鼠腸道黏膜損傷的保護(hù)作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，旨在為開發(fā)以魷魚墨多糖為功效因子的輔助化療保健食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑、動(dòng)物 注射用環(huán)磷酰胺(批號(hào):12042725)為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品。北太平洋魷魚墨多糖為中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與人類健康實(shí)驗(yàn)室制取。Balb/c近交系小鼠，♂，7－8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，SPF級(jí)，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［動(dòng)物合格證編號(hào):SCXK(京)2012-000］。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0012S)購于碧云天生物技術(shù)研究所。超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒(A001-3)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(A003-1)購于南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) Balb/c小鼠于動(dòng)物房適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，按照體重隨機(jī)分為5組，每組10只，即正常組、環(huán)磷酰胺模型組、魷魚墨多糖低劑量組50 μg·g－1bw、中劑量組 100 μg·g－1bw、高劑量組 200 μg·g－1bw。正常組、模型組經(jīng)口灌胃生理鹽水作為對(duì)照，各劑量組經(jīng)口灌胃相應(yīng)濃度的魷魚墨多糖，1次/天，連續(xù) 28 d。d 26，27，按 50 μg·g－1bw 的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺建立化療小鼠模型，正常組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水作為對(duì)照。d 29將小鼠摘眼球處死，取小腸組織備用。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察 取小腸空腸段約3～4 cm置于10%中性甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋后制作石蠟切片，并進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察并拍照記錄。每組取5只小鼠的切片，每只小鼠取3個(gè)不同視野，每個(gè)視野隨機(jī)選擇5個(gè)完整的絨毛－隱窩單位進(jìn)行測(cè)量小腸絨毛高度(以腸腺絨毛連接處到絨毛頂端為準(zhǔn))、隱窩深度(以腸腺絨毛連接處到腸腺基部為準(zhǔn))，并計(jì)算絨毛高度與隱窩深度的比值(V/C比值)。

1.4 差異蛋白分析 取小腸回腸段約3 cm，加入RIPA裂解液勻漿。經(jīng)BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定后，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，考馬斯亮藍(lán)染色。顯影結(jié)果經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)(GIS-2008型，上海天能)灰度掃描、拍照。取特異性高表達(dá)的蛋白條帶，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成質(zhì)譜鑒定。主要內(nèi)容包括:脫色，酶解，ABI 4800串聯(lián)質(zhì)譜(Maldi-Tof-Tof/MS)分析，氨基酸序列比對(duì)后獲得特異性蛋白質(zhì)的詳細(xì)信息。

1.5 小腸勻漿上清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的測(cè)定 小腸組織勻漿后取上清，按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活力，采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量。

2 結(jié)果

2.1 魷魚墨多糖對(duì)小鼠飲食、腹瀉狀況和體重的影響 正常組小鼠的進(jìn)食量與飲水量均無明顯變化，無腹瀉現(xiàn)象發(fā)生;其余各組小鼠在注射環(huán)磷酰胺后均出現(xiàn)體重減輕的現(xiàn)象，其中，高劑量組下降的幅度最小，中劑量組下降的幅度最大，模型組次之(Fig 1)。此外，各組小鼠的進(jìn)食量及飲水量也有所減少，其中部分小鼠出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象，糞便呈稀黃狀;注射環(huán)磷酰胺后d 3腹瀉現(xiàn)象加重，小鼠活動(dòng)量減少，尤以模型組表現(xiàn)最為嚴(yán)重。

2.2 魷魚墨多糖對(duì)小腸絨毛高度、隱窩深度及V/C值的影響 模型組小鼠小腸絨毛長度低于正常組小鼠，且差異有顯著性(P＜0.01);與模型組相比，中劑量組和高劑量組絨毛長度增加(P＜0.01)，但低劑量組降低(P＜0.01)(Fig 2)。模型組小鼠小腸隱窩深度高于正常組小鼠，且差異有顯著性(P＜0.05);與模型組相比低、中、高劑量組隱窩深度降低(P＜0.01)(Fig 3)。模型組小鼠V/C值低于正常組，且有差異顯著性(P＜0.01);與模型組相比低、中、高劑量組V/C值升高(P＜0.01)(Fig 4)。

Fig 1 Change of mice body weight before and after building model

Fig 2 Effects of squid ink polysaccharide onvillus length of mice(ˉ ± s，n=5)

Fig 5 SDS-PAGE result of intestinal tissue

Fig 6 Mass spectrometry identification results

2.3 SDS-PAGE分析小腸組織蛋白表達(dá)差異 為了探討魷魚墨多糖對(duì)化療小鼠消化道不良反應(yīng)的預(yù)防作用機(jī)制，采用SDS-PAGE蛋白電泳方法，尋找小腸組織差異表達(dá)的蛋白質(zhì)(Fig 5)。對(duì)差異表達(dá)的蛋白條帶A進(jìn)一步脫色，酶解，進(jìn)行Maldi-Tof-Tof/MS質(zhì)譜分析。質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示(Fig 6)，該蛋白為谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶ω-1(glutathione S-transferases omega-1，GSTsω-1)(27 ku)。2.4 魷魚墨多糖對(duì)小腸組織勻漿上清中MDA與SOD含量的影響 為了探究魷魚墨多糖對(duì)小鼠腸道氧化應(yīng)激損傷的改善作用，按照試劑盒操作步驟，檢測(cè)各組小鼠小腸勻漿上清液中MDA與SOD的含量(見Tab 1、2)。與正常組相比，模型組小鼠腸道MDA含量增高，而魷魚墨多糖組小鼠腸道MDA含量明顯下降，且低、中、高劑量組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P ＜0.05，P ＜0.01)。與正常組相比，模型組小鼠腸道SOD活力降低，魷魚墨多糖組小鼠腸道SOD活力明顯上升，其中高劑量組最明顯(P＜0.01)。

Tab 1 Effects of squid ink polysaccharide onMDA level in mice small intestine(n=10)

Tab 2 Effects of squid ink polysaccharide on SOD activityin mice small intestine(n=10)

3 討論

環(huán)磷酰胺是治療惡性腫瘤常用的化療藥物，具有廣譜抗癌作用，是聯(lián)合化療、手術(shù)和放療輔助化療的常用藥物之一［11］。環(huán)磷酰胺的毒副作用主要是免疫抑制［12］和胃腸道不良反應(yīng)。本課題組研究表明，連續(xù)6 d給予正常小鼠腹腔注射50 mg·(kg·bw)－1的環(huán)磷酰胺后，小腸黏膜完整性遭到破壞，小腸絨毛變短且稀疏散置，腸道SIgA分泌量減少［13］。提示可以利用環(huán)磷酰胺構(gòu)建腸黏膜損傷的動(dòng)物模型。

小腸是機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的主要部位，小腸絨毛高度的增加代表著小腸吸收營養(yǎng)物質(zhì)的面積增大，因此，小腸絨毛的長短與小腸的消化吸收能力有密切關(guān)系［14］。小腸隱窩是絨毛根部上皮陷入固有層形成的管狀腺。隱窩深度主要反映了上皮細(xì)胞的生成率，上皮細(xì)胞不斷從隱窩基部向絨毛端部遷移、分化，形成具有吸收能力的絨毛細(xì)胞，以補(bǔ)充正常或意外損傷導(dǎo)致的脫落［15］。當(dāng)腸道受到侵襲或應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，腸絨毛就會(huì)受損變短，絨毛上皮細(xì)胞就會(huì)減少，隱窩細(xì)胞便不斷產(chǎn)生大量具有分泌功能的未成熟上皮細(xì)胞以補(bǔ)充絨毛細(xì)胞，表現(xiàn)為隱窩深度變深，這種細(xì)胞的過量增加會(huì)導(dǎo)致機(jī)體腹瀉的發(fā)生。絨毛高度/隱窩深度的比值(V/C值)則綜合反映小腸的功能狀態(tài)。比值下降，表示消化吸收功能下降，常伴隨腹瀉的發(fā)生。比值上升，腹瀉率下降［16］。本研究結(jié)果顯示:模型組小腸絨毛高度和V/C值明顯低于正常組，隱窩深度明顯高于正常組，說明環(huán)磷酰胺能夠造成小腸黏膜上皮細(xì)胞損傷，而前期攝入魷魚墨多糖可以提高小腸絨毛長度，保護(hù)小腸隱窩，減少腹瀉的發(fā)生，提示其對(duì)小腸黏膜損傷具有保護(hù)作用。

為了探究魷魚墨多糖對(duì)環(huán)磷酰胺所致小腸黏膜損傷的保護(hù)作用機(jī)制，本文進(jìn)一步分析了各組之間差異性表達(dá)的蛋白質(zhì)。Maldi-Tof-Tof/MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，魷魚墨多糖高劑量組谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶ω-1(27 ku)表達(dá)量增加。谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是普遍存在于各種生物體內(nèi)的Ⅱ相代謝酶，能夠水解、滅活化學(xué)致癌物代謝中親電子疏水化合物，促其排出體外，具有解毒功能［17－18］。GSTs ω-1是GST omega家族中的一員，其在高劑量組中的特異性高表達(dá)表明魷魚墨多糖可以促使GSTs ω-1的產(chǎn)生，推測(cè)其可能參與降低腸道氧化應(yīng)激損傷的反應(yīng)。進(jìn)一步對(duì)小腸組織勻漿液中MDA含量和SOD活力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)魷魚墨多糖對(duì)腸道的氧化應(yīng)激損傷具有改善作用。因此，魷魚墨多糖對(duì)環(huán)磷酰胺所致腸黏膜損傷的保護(hù)作用與它能夠改善腸道氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

本研究在分析小腸組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)的過程中發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，魷魚墨多糖高劑量組的蛋白條帶明顯增多，提示該組小鼠小腸組織一些蛋白質(zhì)出現(xiàn)特異性表達(dá)增高，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究表明環(huán)磷酰胺能夠造成小鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷，魷魚墨多糖前期攝入可以保護(hù)小腸絨毛、隱窩，維持腸黏膜屏障的完整性，上述作用與其提高小腸抗氧化應(yīng)激能力有關(guān)。本文研究結(jié)果為開發(fā)以魷魚墨多糖為功效因子的輔助化療保健食品提供了一定的理論依據(jù)。

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