三七總皂苷對H9c2細胞P450酶mRNA表達的影響

胡東華，王宇光，陳志武，馬增春，梁乾德，肖成榮，譚洪玲，湯響林，高 月

三七總皂苷(panax notoginseng saponin，PNS)是五加科植物三七［Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen］的主要活性成分，其在三七中的含量高達12%。PNS中三七皂苷 R1、人參皂苷Rb1、Rg1、Rd和Re為其主要成分，約占總皂苷含量的80%［1］，具有防止脂質在血管內沉積，抑制血管平滑肌細胞增殖，促纖溶及抑制血小板聚集，促進微循環，抗動脈粥樣硬化，保護心肌等作用［2－3］。是臨床用血栓通的主要成份，主要用于擴張血管，改善血液循環。

細胞色素P450酶(CYP450)最初發現于肝臟中，其在生物轉化、藥物代謝、解毒等方面進行廣泛深入的研究;近年來發現心臟中也含有CYP，并且以CYP2和CYP4家族為代表與心血管疾病密切相關的CYP亞型也成為研究熱點，內源性物質花生四烯酸(arachidonicacid，AA)經P450酶途徑的代謝產物對心血管系統的影響近年來日益受到重視［4］。近年來許多CYP家族在心臟、血管內皮細胞和平滑肌細胞中得以鑒定，同時很多證據顯示內源性物質經CYP的代謝產物在維持心血管內環境穩態中發揮重要作用［5］。研究表明，花生四烯酸可被CYP環氧酶(CYP2C11，2J3)代謝為環氧二十碳三烯酸(EET)或被 CYP ω-羥化酶(CYP4A，4F)代謝為20-羥基二十碳四烯酸(20-HETE)［6］。

以往對于PNS的藥理機制研究主要集中在對心肌的保護作用、鈣拮抗作用、對抗心肌肥大、抑制心室重構、抑制血管平滑肌細胞的增殖、抗血栓形成和抗動脈粥樣硬化、保護血管內皮細胞作用、肝臟P450酶等方面［7－9］。目前尚未見 PNS對心臟細胞色素P450調控的研究，鑒于近年來發現心臟細胞色素P450在心血管系統中同樣執行重要功能，PNS作為治療心腦血管疾病的臨床常用藥物，其對心肌細胞色素P450影響和機制仍不是十分清楚。本研究利用Real Time PCR方法從心臟P450酶的層面考察PNS處理心肌細胞H9c2，細胞色素P450亞型表達的變化，以評價PNS對心臟P450酶亞型是否有抑制或誘導效應，為進一步深入研究PNS以心臟P450為靶點的心血管藥理效應的機制提供線索，同時為指導臨床合理用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及藥品 PNS［廣西梧州制藥(集團)股份有限公司］，依據國家藥品標準 WS-10460-(ZD-0460)-2002-2011Z檢驗合格;DMEM和血清(FBS)(Hyclone);胰酶(Sigma);MTS試劑盒(Promega);LDH試劑盒(普利萊基因技術有限公司);PBS(北京凱欣杰生物技術有限公司);RNApure超純總RNA快速提取試劑盒(博邁德生物);Trans ScriptTMOne-Step RT-PCR Super Mix(北京全式金生物技術有限公司);Fast SYBR@Green Master Mix(Applied Biosystems)，其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器 細胞培養箱(NAPCO 5410);超凈工作臺(北京長城空氣凈化設備公司);倒置顯微鏡(Nikon 120型);Victor X5酶標儀(Perkin Elmer)PCR儀(Gene Amp 2400);核酸蛋白分析儀 (Beckman DU640);StepOne PlusTMReal Time PCR(Applied Biosystems)。

1.3 細胞培養 H9c2心肌細胞株來源于大鼠胚胎期心臟組織(購自北京協和細胞庫)，在37℃、5%CO2的條件下，培養于含有10%胎牛血清和高糖DMEM培養基中，融合率為80% ～90%時，按1∶3的比例傳代。

1.4 PNS 母液配制(200 g·L－1)［10］精確稱取2.000 g的PNS粉末，加入5 ml的去離子水，緩慢攪拌使其溶解，再加去離子水定容至10 ml，攪拌使其充分溶解;用0.22 μm孔徑的微孔濾器過濾除菌;分裝至1.5 ml EP管，4℃冰箱保存。

1.5 MTS法檢測H9c2細胞活性 用DMEM培養基將對數生長期的H9c2細胞以2×104個/孔密度接種于96孔培養板(空白孔不種細胞)，200 μl/孔，37℃、5%CO2培養 24 h;實驗分為空白組，PNS組(濃度依次為 0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 g·L－1)和陰性對照組，培養48 h;每孔加MTS液8 μl，繼續孵育4 h;用酶標儀測定490 nm處的光密度值(OD);按以下公式計算細胞存活率。

細胞存活率(IC)/%=(實驗組OD值－空白組OD值)/(陰性對照組OD值－空白組OD值)×100%

1.6 乳酸脫氫酶比色法(LDH)檢測H9c2細胞損傷 對數生長期的H9c2細胞以2×104個/孔密度接種于96孔培養板(空白孔不種細胞)，200 μl/孔，37℃、5%CO2培養24 h;實驗分組如上，培養48 h后，按照LDH試劑盒操作說明進行試驗，按以下公式計算細胞的損傷。

細胞LDH釋放率/%=細胞培養基中測定的酶活力單位/(細胞裂解液測定的酶活力單位+細胞培養基測定的酶活力單位)×100%

1.7 Real Time PCR測定H9c2細胞CYP450 mRNA水平影響 實驗分為空白對照組，PNS組(濃度依次為 0.3125、0.625、1.25、2.5、5 g·L－1)接種 6孔板中，給藥48 h后取各處理組H9c2細胞，按試劑盒說明提取心肌細胞總RNA，電泳分析表明18S和28S條帶清晰可見，A260/A280比值在 1.7～2.0，總RNA片段完整未降解可用。取 2 μg RNA按照TransScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix說明進行逆轉錄反應，42℃ 30 min;85℃ 5 min。用 ABI StepOne PlusTMReal Time PCR進行 PCR反應，取2.0 μl逆轉錄反應產物作為PCR反應模板，加入上下游引物 20 μmol· L－1各 0.5 μl，Fast SYBR@Green Master Mix 10 μl，補充 Rase-free water 至 20 μl。反應參數:95℃ 20 s預變性，95℃ 3 s變性，60℃ 30 s退火，共40個循環。每次擴增設置β-actin內參照，進行PCR擴增產物的實時定量分析，用2－(△△Ct)方法分析。特異性引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primers sequence used in Real Time PCR analy

1.8 統計學分析 所有數據重復3次，每次設置3個復孔，收集數據進行統計學分析。實驗數據用ˉ±s表示，采用SAS統計學軟件，兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 MTS法檢測H9c2細胞活性 以PNS(濃度依次為 0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 g·L－1)處理H9c2細胞48 h以后，測定各處理組細胞存活率，結果顯示隨著三七總皂苷濃度的升高，細胞的存活率逐漸下降。低濃度的PNS對細胞的存活率沒有影響(如0.3125、0.625 g·L－1)。用Origin8.0 軟件擬合計算IC50(5.28±0.08)g·L－1(Fig 1)。

2.2 乳酸脫氫酶比色法(LDH)檢測H9c2細胞損傷 對各處理組細胞的LDH進行測定，結果顯示以PNS處理H9c2細胞48h后，隨著PNS濃度的升高，乳酸脫氫酶的釋放率逐漸增大，與空白組比較，5、10、20 g·L－1組的 LDH 釋放率明顯增高(P＜0.01)，而 0.3125、0.625、1.25 g·L－1組的 LDH 釋放率沒有變化(Fig 2)。

Fig 1Effect of PNS on cell viability of H9c2 cells(ˉ±s，n=5)

Fig 2Effect of PNS on LDH release rate of H9c2 cells(ˉ±s，n=5)

2.3 PNS對H9c2細胞P450酶 mRNA表達的影響

2.3.1 PNS對 H9c2細胞 CYP2C11和 CYP2J3亞型mRNA水平的影響 PNS對H9c2細胞CYP450酶Ⅱ家族mRNA表達的影響如Fig 3所示，與空白組比較，PNS對CYP2C11有下調趨勢(P＜0.05或P＜0.01)，而對CYP2J3有上調作用，且作用比較明顯(P＜0.01)。

2.3.2 PNS對 H9c2細胞 CYP4家族中 CYP4A1、CYP4A2、CYP4A3、CYP4F1、CYP4F4 和 CYP4F5 亞型mRNA水平的影響 如Fig 4所示，PNS對H9c2細胞 CYP4家族中 CYP4A1、CYP4A2、CYP4F1和CYP4F5有上調趨勢(P＜0.01)，并且有一定的濃度依賴性。PNS對CYP4A3和CYP4F4，在低濃度時有下調作用(P＜0.05或P＜0.01)，而在最大濃度時，對這兩個亞型有一定的上調作用(P＜0.01)。

3 討論

Fig 3Effect of PNS on CYP2C11 and CYP2J3 gene expression of H9c2 cellsˉ±s，n=3)

細胞色素P450(CYPs)酶是混合功能氧化酶系，多表達于肝臟，人體內約有75%的藥物通過CYP450代謝［11］。EETs具有抗炎，抑制平滑肌細胞增殖與遷移，調節血管張力，促纖溶，抗動脈粥樣硬化等作用，在心腦血管中有著廣泛的生物學效應，主要有CYP2C11和 CYP2J3參與［12］。20-HETE在大鼠中主要由CYP450酶4家族代謝，這是一種強有力的縮血管物質，對血壓調節有重要影響，主要有CYP4A和4F參與［13］。因此本文從心臟的主要藥物代謝酶為研究對象，研究PNS對上述CYP亞型表達的影響，旨在探討PNS對心血管藥理作用新的可能機制。

Fig 4Effect of PNS on CYP4A1，CYP4A2，CYP4A3，CYP4F1，CYP4F4 and CYP4F5 gene expression of H9c2 cells(ˉ±s，n=3)

MTS的測定結果可以反映細胞的存活程度。細胞受到損傷時，激活一系列的酶促反應造成細胞內LDH大量外釋，并且誘導細胞的進一步損傷。通過PNS處理H9c2細胞48 h后，MTS結果表明隨著PNS濃度的增大，細胞的存活率逐漸降低，并且呈濃度依賴性，低濃度對細胞的存活率沒有影響(如 0.3125、0.625 g·L－1);LDH 的釋放率隨著濃度的升高而逐漸增大，0.3125、0.625、1.25 g·L－1組的LDH釋放率沒有變化。提示PNS在高濃度時可能會對細胞有一定的損傷。PNS對大鼠腎小球系膜細胞有一定的抑制作用，并呈劑量依賴性［14］。有研究顯示PNS在治療劑量下對肝臟損傷有保護作用，大劑量(150 mg·kg－1)對大鼠有肝腎毒性，在150 mg·kg－1以上時對心臟功能具有毒性效應［15－16］。結合本次研究結果，提示臨床應用此類藥物時應注意劑量。

CYP2J2/3主要表達于心臟，且主要合成具有心臟保護作用的EETs，而EETs有擴張血管的作用。大鼠心臟CYP2J3與人類心臟CYP2J2具有70%的同源性。Bhatnagar［17］研究發現 CYP2J對心臟表現為保護作用，而CYP2C則表現為加重損傷，提出CYP450不同亞型可能因產生氧自由基不同，而表現為加重或拮抗心肌缺血/再灌注損傷。PNS各濃度對CYP2C11有下調趨勢，而對CYP2J3有上調作用，提示PNS有一定的保護心臟，擴張血管的作用。CYP450酶4家族羥化酶代謝花生四烯酸產生20-HETE，這是一種強有力的縮血管物質。PNS各濃度對 H9c2細胞 CYP4家族中 CYP4A1、CYP4A2、CYP4F1和CYP4F5有上調趨勢，而對 CYP4A3和CYP4F4在低濃度時有下調作用，而在最大濃度時(5 g·L－1)，對這兩個亞型有一定的上調作用，這可能是高濃度對細胞的影響的結果。

PNS作為臨床用血栓通的主要成份，本研究結果顯示高濃度的PNS可能會有一定的毒性。同時PNS對CYP450酶不同的亞型有不同程度的誘導或者抑制作用，提示PNS對心臟和血管有一定的保護作用。因此使用PNS時應注意用藥劑量，使其發揮療效而盡量減少藥物不良反應的發生，同時在臨床應用時注意用藥劑量。

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