三七皂苷R1對肺高壓大鼠模型肺動脈的舒張作用

胡 瑩，焦海霞，王瑞幸，郭立成，穆云萍，林默君

肺高壓(pulmonary hypertension，PH)是指由異源性疾病和不同發病機制引起的以肺動脈壓力增高為表現的疾病狀態［1－2］，其主要病理改變為肺血管阻力進行性增加，進而引起肺動脈壓力增高、肺血管重塑，最終引起右心衰竭甚至死亡［2］。所以，PH屬于進展性疾病，嚴重威脅人類健康。肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterialsmooth muscle cells，PASMCs)膜上主要存在3種鈣離子通道:L-型電壓依賴性鈣離子通道(L-VDCC)、受體操縱性鈣離子通道(receptor-operated calcium channels，ROCC)和鈣池操縱性鈣離子通道(store-operated calcium channels，SOCC)，這3個通道共同參與細胞內Ca2+穩態的維持［3］。我們先前的工作證實，在慢性低氧(chronic hypoxia，CH)暴露和野百合堿(monocrotaline，MCT)單劑量注射誘導的兩種PH模型的肺動脈(pulmonary arteries，PAs)上，SOCC 表達上調，所介導的鈣池操縱性鈣內流(store-operated calcium entry，SOCE)和血管收縮均明顯增強［4－5］。目前，PH治療藥物主要包括前列環素、內皮素以及NO類似物［6］，但這些藥物僅能部分改善PH癥狀，對PH預后并不理想。

三七總皂苷(panaxnotoginseng，PNGS)是從傳統中藥三七中提取的活性成分，具有抑制由二磷酸腺苷(ADP)引起的血小板聚集、擴張腦血管、抗血栓和抗凝血作用。三七皂苷R1(notoginsenoside R1)是PNGS的主要活性成分之一［6］，近期有研究發現［7］，三七皂苷R1能夠抑制血小板膜上的非電壓依賴性Ca2+通道介導的Ca2+內流，降低血小板活性。但這種傳統中藥單體能否抑制PH大鼠肺動脈平滑肌細胞膜上SOCE的作用目前未見報道。本研究采用CH和MCT致PH模型，檢測三七皂苷R1對模型大鼠肺動脈的舒張效應，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 兩種肺高壓模型的建立 健康SD大鼠，♂，體質量180～200 g，購自福建醫科大學實驗動物中心［SCXK(閩)2012－0001］，隨機分成正常對照組(CON組)、慢性低氧模型組(CH組)和MCT模型組(MCT組)。CON組:SD大鼠正常飼養3周;CH組:大鼠置于常壓、密封的有機玻璃箱內飼養，箱內的氧分壓降至10.0%±0.5%;MCT組:SD大鼠以20 mg·L－1的MCT按60 mg·kg－1劑量一次性腹腔注射。兩種模型大鼠均正常飼養3周。

1.2 右心室內壓測定 SD大鼠腹腔注射肝素(Heparin，50 IU·kg－1)，5 min 后氨基甲酸乙酯(1 g·kg－1)腹腔麻醉，做右頸外靜脈插管直到右心室，記錄大鼠右心室平均內壓(mean right ventricle pressure，MRVP)和右心室收縮壓 (right ventricle systolic pressure，RVSP)。

1.3 右心室重量指數測定 測完右心室內壓，迅速開胸取出心臟及肺。沿房室交界處剪去左右心房及大血管，分離右心室(RV)及左心室+室間隔(LV+S)，用濾紙吸去多余水分，分別稱重，計算RV/(LV+S)，即右心室重量指數 (right ventricular mass index，RVMI)。

1.4 肺動脈血管張力檢測 測完右心室內壓，迅速開胸取出肺葉，在體視顯微鏡下分離肺葉內的肺小動脈，并將其剪成約4～5 mm的肺動脈環，將去內皮后的血管環置于四腔浴槽中，并予1 g負荷，經換能器轉換后在RM6240C多道生理記錄儀(成都儀器廠)上描記張力曲線，平衡2h。實驗前給予60 mmol·L－1KCl收縮血管，重復3次，連續兩次得到的收縮幅度差小于10%則認為標本反應可重復，否則棄之。血管環加入苯腎上腺素(終濃度0.1 μmol·L－1)，待預收縮反應達平臺后，加入乙酰膽堿(10 μmol·L－1)，觀察其對血管的舒張效應，以驗證血管環內皮去除與否，血管環出現明顯舒張的棄之。隨后，觀察內皮素-1(Endothelin-1，ET-1，Sigma)或環匹阿尼酸(Cyclopiazonic acid，CPA，Sigma)預收縮作用后三七皂苷R1(成都格雷西亞化學技術有限公司)或釓離子(gadolinium，Gd3+，Sigma)的抑制作用，各種藥物誘發PAs的收縮作用以60 mmol·L－1KCl收縮效應的百分數來標準化;用以下公式計算阻斷劑的抑制率:

2 結果

2.1 PH大鼠模型鑒定 大鼠慢性低氧飼養3周后，MRVP和 RVSP從 CON組(n=17)的(1.5±0.4)kPa和(3.7±0.6)kPa分別增加到CH組(n=17)的(2.6±0.7)kPa(P＜0.01)和(7.1±1.1)kPa(P＜0.01);大鼠以 20 mg·L－1的 MCT按60 mg·kg－1劑量一次性腹腔注射，3周后，MRVP和RVSP分別增加到MCT組(n=21)的(4.0±1.6)kPa(P＜0.01)和(8.1±2.4)kPa(P＜0.01);而CH和MCT組體循環動脈壓和心率均沒有差別［8］，提示右心室內壓增高。RVMI從CON組的27.6%±2.8%分別增加至38.6% ±5.0%(CH組，P＜0.01)和46.7% ±14.1%(MCT組，P ＜0.01)，表明右心重構，右心室肥大，提示兩種PH大鼠模型制備成功 (Fig 1)。

Fig 1 Mean right ventricle pressure(MRVP)，right ventricle systolic pressure(RVSP)and right ventricle mass index(RVMI)in different groups

2.2 三七皂苷R1呈劑量依賴性阻斷ET-1對PAs的預收縮效應 CON組大鼠觀察三七皂苷R1對10 nmol·L－1ET-1預收縮去內皮PAs的劑量依賴性舒張效應。在 3 μmol·L－1的硝苯地平(Nifedipine，Nif)阻斷L-VDCC后，以10 nmol·L－1ET-1預收縮PAs，在 ET-1收縮反應達穩定后，加入不同劑量(0.1 ～100 μmol·L－1)的三七皂苷 R1，結果顯示:三七皂苷R1呈劑量依賴性阻斷ET-1預收縮的PAs，最大舒張效應為Emax為32.5% ±16.3%，EC50為 5.25 ±0.14 μmol·L－1(n=8，Fig 2)。

Fig 2 The dose-dependent curve of notoginsenoside R1 on ET-1(10 nmol·L －1)-preconstricted PAs of control rats

2.3 Gd3+和三七皂苷R1對PH大鼠ET-1預收縮PAs的阻斷效應 CH組和MCT組大鼠去內皮PAs經10 nmol·L－1ET-1預收縮達穩定后，加入可特異性阻斷SOCC的Gd3+(3 nmol·L－1)后，PAs張力均明顯下降，CH組由117.8% ±20.8%下降至31.9%±8.2%(n=15，P ＜0.01)，MCT組由 111.0% ±26.5%下降至30.8% ±9.5%(n=15，P＜0.01)，兩組再分別加入6 μmol·L－1三七皂苷R1沒有出現進一步的舒張作用(CH組:28.0% ±9.2%，MCT:27.2% ±10.5%，Fig 3)。提示:在 3 nmol·L－1Gd3+特異性阻斷SOCE后，三七皂苷R1不能進一步對ET-預收縮的PAs產生舒張作用。

2.4 三七皂苷R1對CPA預收縮PH大鼠PAs的舒張作用 CH組和MCT組大鼠去內皮PAs，肌漿網鈣泵特異性抑制劑 CPA(10 μmol·L－1)預收縮達穩定后，分別加入6 μmol·L－1三七皂苷 R1，觀察其對CPA預收縮PAs的阻斷作用。結果顯示，6 μmol·L－1三七皂苷 R1能部分阻斷 CPA預收縮PAs效應，CH組由116.9% ±25.2%下降至76.1%±23.4%，抑制率為 39.6% ±17.0%(n=7，P＜0.01，Fig 4);MCT組由105.7% ±30.0%下降至70.3% ±270.8%，抑制率為40.9% ±11.2%(n=14，P＜0.01，Fig 4)。提示:三七皂苷 R1可通過阻斷SOCE，舒張PH大鼠的PAs。

Fig 3 Vasorelaxant effects of Gd3+(3 nmol·L －1)and notoginsenoside R1(6 μmol·L －1)on ET-1(1 nmol·L －1)-preconstricted PAs of CH-and MCT-treated rats

Fig 4 Vasorelaxant effects of notoginsenosideR1(6 μmol·L －1)on CPA(10 mol·L －1)-preconstrictedPAs of CH-and MCT-treated rats

3 討論

三七總皂苷是五加科人參屬植物三七的主要有效活性成分，包含多種皂苷單體，具有擴張血管、降低心肌耗氧量、減輕心肌炎損傷、抑制血小板凝集、延長凝血時間、降血脂、清除氧自由基、抗炎、抗氧化等藥理作用，主要用于心腦血管系統疾病的治療［6］。三七皂苷單體R1是三七總皂苷的活性成分之一，對可興奮細胞及非可興奮細胞的Ca2+內流都有影響，主要通過調節內皮細胞、血管平滑肌細胞等操縱的Ca2+內流發揮藥理作用［9］。然而，三七皂苷R1對PH發病的治療作用是否與PASMCs膜上的SOCC有關，尚未見報道。

本研究分別采用CH和MCT兩種方法，建立PH大鼠模型，結果顯示兩種模型大鼠的 MRVP、RVSP和RVMI均明顯升高，提示兩種PH模型制備成功，同時，本研究旨在探討三七皂苷R1對PH大鼠PASMCs膜上SOCC的作用。Nif是L-VDCC的阻斷劑［3］，本研究在Nif預處理排出L-VDCC作用的前提下，采用激動劑ET-1誘發正常大鼠PAs收縮，觀察三七皂苷R1對非電壓依賴性Ca2+通道介導的Ca2+內流的阻斷作用。結果發現，三七皂苷R1能部分舒張ET-1誘發的PAs收縮，且呈劑量依賴性，該結果表明三七皂苷R1可能通過部分阻斷非電壓依賴性Ca2+通道介導的Ca2+內流，達到舒張肺血管作用。

為明確三七皂苷R1究竟是通過阻斷PAs上的何種非電壓依賴性Ca2+通道發揮舒張血管作用，本研究選擇Gd3+阻斷ET-1誘發PAs收縮。Gd3+為鑭系元素，對SOCC介導的Ca2+內流有高度的選擇性，在很低濃度時即可以將其阻斷［10］。本部分研究在Nif阻斷L-VDCC的前提下，采用激動劑ET-1誘發PAs收縮，再用Gd3+阻斷ET-1誘發的PH大鼠PAs收縮，在此基礎上觀察三七皂苷R1對PAs的進一步舒張效應。結果證實，在Gd3+阻斷PAs收縮后，三七皂苷R1對PAs無進一步舒張效應。提示三七皂苷R1對ET-1誘發PAs收縮的舒張效應是由于部分阻斷了SOCC介導的Ca2+內流引起的。

為進一步證實R1通過部分抑制SOCC介導的Ca2+內流舒張PAs，本實驗觀察三七皂苷R1對CPA誘發PH大鼠PAs收縮的抑制作用。CPA是一種肌漿網Ca2+泵耗竭劑，可特異性觸發SOCC介導的Ca2+內流［4－5，11－12］。因此，我們采用 SOCC 激動劑CPA誘發PAs收縮，觀察三七皂苷R1對肺動脈血管的舒張效應。結果發現，三七皂苷R1能使CPA誘發的PAs收縮效應部分舒張，而這種作用是通過部分抑制SOCC介導的Ca2+內流引起的。該結果進一步證實了三七皂苷R1可通過部分抑制SOCC介導的Ca2+內流舒張PAs。

總之，三七皂苷R1可能通過阻斷鈣池操縱性鈣內流介導的PAs收縮產生治療PH作用。

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