早秋蘿卜不育系花藥形態(tài)比較及細胞學觀察

劉育華 ，李德超 ，駱海波 ，賀從安 ，張小康 ，熊秋芳 ，張貴生 ，李世升

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學研究所，430345；2.武漢市蔬菜科學研究所）

蘿卜作為重要的蔬菜作物對我國經(jīng)濟社會發(fā)展有著不可替代的作用。蘿卜雄性不育系在蘿卜種質(zhì)優(yōu)化及蘿卜種子生產(chǎn)過程中貢獻巨大[1，2]。蘿卜的雄性不育有兩大類型：細胞核雄性不育和核-質(zhì)互作雄性不育。細胞核雄性不育只能獲得不育株率為50%的雄性不育兩用系，故其應用受到極大限制。武漢市蔬菜科學研究所十字花科研究室在以張雪清為首的老專家?guī)ьI下，先后育成系列蘿卜不育系20多套，并利用雜交手段，成功育成春夏紅皮蘿卜（春紅一號）、春夏白皮蘿卜（春白一號、春白二號、春雪）、夏秋白皮蘿卜（夏抗40天）、夏秋紅皮蘿卜（雙紅一號、紅寶）、早秋白皮蘿卜 （中秋白、60早生）、秋冬蘿卜（三白蘿卜、武青一號、武雜一號、武雜三號蘿卜）、冬春蘿卜（四月白、春雪）、加工蘿卜（武漬一號）等品種。自這些品種選育至今，已在我國大面積推廣，種植面積超過2萬hm2。隨著對蘿卜發(fā)育規(guī)律研究的不斷加強和逐步深入[3～8]，蘿卜雄性不育在細胞發(fā)育形態(tài)、生理生化及分子調(diào)控水平方面 都 取 得 了 重 大 進 展[3，4，6]，但 由 于 蘿 卜 雄 性 不 育 遺傳機制的復雜性及試驗材料的差異性，研究結果不完全一致。為加強對原有品種的更新及開發(fā)力度，以早秋蘿卜不育系12-A及其對應保持系為材料，從器官形態(tài)學及細胞形態(tài)學水平對小孢子敗育的時期和原因進行分析，試圖為揭示該品種蘿卜的雄性不育機理提供思路和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為早秋蘿卜不育系12-A及其保持系12-B，種植于武漢市蔬菜科學研究所武湖基地。按常規(guī)方法對上述蘿卜品種進行栽培和管理。

1.2 試驗方法

①花藥組織切片 a.固定與脫水。將分選好的花藥長度分別為1，2，3，4 mm的花蕾放入固定液（4%多聚甲醛，0.1%TritonX-100，1xPBS，pH 值7.4）中4℃固定過夜后，用 1xPBS（pH 值 7.4）清洗 3次，每次10 min。然后用體積分數(shù)分別為10%，30%，50%，75%，95%的乙醇依次脫水至100%乙醇，每級1 h。最后更換2次無水乙醇，各處理1 h。

b.浸蠟。將脫好水的材料放入Steedman'sWax與無水乙醇（1∶1）混合液中37℃處理過夜。次日早上，棄去上述混合液，換成純的Steedman'sWax，37℃滲透1 h。更換新的蠟，并和材料一起轉入錫箔紙盒中室溫凝固1 h，隨即放入4℃冰箱進一步凝固。

c.切片。由于Steedman'sWax熔點僅為37℃，而在23℃以上會變得很軟，所以整個操作過程需要在23℃以下進行，否則不利于切片。根據(jù)材料的大小將包埋好的蠟塊切成小塊，并用熔化的蠟將其粘在木塊上 （根據(jù)所要切片的方向擺放），放入冰箱的冷藏室中降溫以保持蠟的硬度。用單面刀片將固定在木塊上的小蠟塊修成梯形。將木塊固定在切片機上，調(diào)整方向至切面與切片刀的刀口平行，且要保證切面的下邊緣與刀口也是平行的，然后進行厚度為10μm的連續(xù)切片。將切好的蠟帶放在預先加有去離子水的玻片（玻片需預先以多聚賴氨酸包被好）上，待其充分伸展后吸干大部分水。貼片室溫過夜即可。

d.脫蠟及封片觀察。將貼好片的載玻片放入盛有無水乙醇的染色缸中脫蠟10 min，并重復該步驟一次。然后經(jīng)過梯度乙醇處理，復水到去離子水中，并用Hoyer's Solution封片。

②花藥形態(tài)及切片顯微觀察 利用SCX-12 Olympus體式熒光顯微鏡觀察花藥外形,Q-imaging CCD取圖；利用Leica觀察切片結果，Cooled-CCD取圖。

③圖像處理 圖像經(jīng)由平板掃描儀、照相機或者各種科研圖像采集儀器配套程序獲得，然后都在Photoshop CS2或Image J軟件中進行調(diào)整，最后在CorelDraw X4軟件中拼成圖版。

圖1 蘿卜母本不育系及保持系花藥形態(tài)

2 結果與分析

2.1 不育系和保持系蘿卜花藥形態(tài)比較

花器官形態(tài)一直以來都是廣大育種工作者在不育系選育過程中的重要標準，尤其是花藥的發(fā)育形態(tài)，因為其好壞是不育系質(zhì)量高低的關鍵因素。通過連續(xù)追蹤觀察12-A不育系及其保持系的早期花蕾及后期盛花形態(tài)，初步比較了二者的形態(tài)差異。

從外形上講，不育系和保持系早期花蕾發(fā)育一致，形態(tài)正常；進一步對盛花（花瓣白色已顯露即將開放，但還沒張開）外形的觀察發(fā)現(xiàn)，12-A不育系花藥明顯折皺、卷曲、褐化且花粉缺失（圖1C、F）。由于花粉的缺失，12-A不育系的雄花最終是完全敗育的。12-A不育系正常花藥形態(tài)的喪失導致花粉不能正常形成，外部形態(tài)觀察只能讓我們了解到花藥形態(tài)的發(fā)育情況，而且只是盛花時期花藥外露后的形態(tài)，早期花形態(tài)比較也沒有發(fā)現(xiàn)有關不育的端倪。因此，若要挖掘不育系形成過程的發(fā)育生物學機理，必須進一步在細胞學水平上深入觀察。

圖2 不育系和保持系花藥細胞結構

2.2 花粉發(fā)育過程中的比較觀察

為了進一步研究蘿卜12-A雄性不育系中花藥敗育及花粉缺失的原因，對早期花藥進行了切片觀察，希望通過對其內(nèi)部細胞結構的了解，在細胞水平上尋找到花粉敗育的原因。

以花藥長度為參考標準，取長2，3mm的花藥做切片觀察。圖2A，B顯示的分別是12-A保持系及不育系的早期花藥（花藥長2 mm）切片結果，結果顯示兩者在花藥早期發(fā)育過程中藥室及花粉早期形態(tài)均正常；圖2C，D顯示的分別是12-A保持系及不育系的早期花藥（花藥長3 mm）切片結果，結果表明此時不育系中花藥藥室結構出現(xiàn)異常，通過放大圖（圖2E和F）可以知道，此時正處于四分體時期。對比結果表明，不育系花藥敗育是在花粉四分體時期左右藥室壁結構崩解所致。

綜合以上結果不難發(fā)現(xiàn)，12-A不育系及保持系的花粉都在正常發(fā)育中，只是由于不育系中花藥藥室壁結構在花粉四分體時期開始崩解導致最終花粉不成熟而完全敗育。花藥藥室壁分內(nèi)壁、中壁及外壁，到底是哪些結構崩解還不得而知。王建波通過電鏡切片觀察蘿卜不育系花藥發(fā)育情況，認為蘿卜805不育系花粉出現(xiàn)敗育是由于藥室壁中層的絨氈層異常所致。因此12-A不育系花藥敗育原因是否因藥室壁中層的絨氈層所致[3]，還需要進一步研究才能確認，但目前可以肯定的是在花粉四分體時期便開始出現(xiàn)敗育，表明12-A不育系中敗育花粉在四分體時期開始停止發(fā)育，導致最終花粉完全敗育。

3 結論

有研究者發(fā)現(xiàn)蘿卜不育系中異常花藥的出現(xiàn)與不育花蕾中淀粉酶活性及總糖、可溶性糖、生長素、淀粉、可溶性蛋白和游離脯氨酸的含量降低有關[1]。法國學者發(fā)現(xiàn)蘿卜Ogura雄性不育由位于細胞質(zhì)線粒體中的orf138和 orfB（atp8）控制，并對相關基因進行了功能研究，進一步發(fā)現(xiàn)細胞核內(nèi)存在著 3個基因 PPR-A，PPR-B和PPR-C可以抑制ORF138在線粒體內(nèi)的聚集從而完成育性恢復[4]。綜合試驗結果表明，蘿卜不育系12-A中花粉在四分體時期開始出現(xiàn)異常，此異常情況是由不育系中花藥藥室壁結構崩解造成。

[1]韓曉雨.蘿卜雄性不育系及其保持系的生理生化分析和SSR標記研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2012.

[2]Ogura H.Studies on the new male sterility in Japanese radish,with special reference to the utilization of this sterility towards the practical raising of hybrid seeds[J].Mem Fac Agric Kagoshima Univ,1968,6:39-78

[3]Shi S L,Ding D,Mei SY,et al.A comparative light and electron microscopic analysis of microspore and tapetum development in fertile and cytoplasmic male sterile radish[J].Protoplasma,2010,241:37-49.

[4]Uyttewaal M,Arnal N,Quadrado M,et al.Characterization of Raphanus sativus pentatricopeptide repeat proteins encoded by the fertility restorer locus for ogura cytoplasmic male sterility[J].The Plant Cell,2008,20:3 331-3 345.

[5]Diggle PK,Abrahamson N J,Baker R L,etal.Dynamics of maternal and paternal effects on embryo and seed development in wild radish(Raphanus sativus)[J].Annals of Botany,2010,106:309-319.

[6]Ian S Curtis.Genetic engineering of radish:current achievements and future goals[J].Plant Cell Rep,2011,30:733-744.

[7]Wang S F,Wang X F,He Q W,et al.Transcriptome analysis of the roots at early and late seedling stages using Illumina paired-end sequencing and development of ESTSSRmarkers in radish[J].Plant Cell Rep,2012,31:1 437-1 447.

[8]Shirasawa K,Oyama M,Hirakawa H,et al.An EST-SSR linkagemap of Raphanus sativus and comparative genomics of the Brassicaceae[J].DNA research,2011,18(4):221-232.