凍干荔枝前處理的酶促褐變控制研究

黃略略，喬 方，方長(zhǎng)發(fā)，張樹飛，馬 煒

(深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院，應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東深圳518055)

懷枝屬于較晚熟荔枝品種，成熟期一般在7月上旬，主要分布在廣東和廣西兩個(gè)省份，尤以廣東最多。懷枝果實(shí)產(chǎn)量高，畝產(chǎn)最高可達(dá)1000kg，果肉晶瑩多汁，鮮品售價(jià)較低，是適合深加工的荔枝品種。冷凍干燥是目前生產(chǎn)高檔荔枝干的主要方法，凍干荔枝色澤白亮，口感松脆，但在后期貯藏過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)37℃條件下，1個(gè)星期左右荔枝干就發(fā)生變色;25℃條件下，10d左右荔枝干也發(fā)生明顯變色［1］;而在4℃條件下，放置1年左右荔枝干顏色幾乎沒(méi)有變化。雖然低溫冷藏可以保持凍干荔枝的外觀色澤不變化，但成本增加，若能使凍干荔枝在常溫下貯藏而顏色不變將有助于降低運(yùn)營(yíng)成本，擴(kuò)大凍干荔枝的銷售。荔枝果肉中存在兩種與顏色變化有關(guān)的酶，過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶［2-4］。在不采取抑制酶活預(yù)處理的條件下，僅靠干制不會(huì)使酶失活，因此在沒(méi)有前處理的凍干荔枝中仍然存在兩種酶活。國(guó)內(nèi)外關(guān)于抑制酶活的研究很多，方法也較為廣泛，如超高壓處理［5］、高壓脈沖電場(chǎng)處理［6］、超聲波協(xié)同處理［7］、微波處理［8］、抑制劑浸泡處理、熱燙處理等，其中應(yīng)用最廣泛的是熱燙處理和抑制劑浸泡處理，熱燙處理能夠徹底使酶失活，但對(duì)原料品質(zhì)破壞較大，結(jié)和抑制劑、微波、超聲波等處理可以縮短熱燙時(shí)間或降低熱燙溫度，從而更夠更好地保持原料的營(yíng)養(yǎng)成分及質(zhì)構(gòu)，這些協(xié)同滅酶方法也因此受到了更多的關(guān)注。本文的目的是尋找有效的抑制酶活的方法，使果肉中的兩種酶全部被抑制，從而為貯藏期的變色研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荔枝 品種為懷枝，采自深圳西麗果場(chǎng)，采摘后冷卻，然后置于-25℃凍庫(kù)中存放，冷凍荔枝用于測(cè)定前處理過(guò)程中的酶活，經(jīng)前處理后的凍干荔枝用于測(cè)定色差和質(zhì)構(gòu);磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、愈創(chuàng)木酚、過(guò)氧化氫、鄰苯二酚、硫酸銨、谷胱甘肽、抗壞血酸、氫氧化鈉 均為分析純?cè)噭?/p>

冷凍離心機(jī) 德國(guó)eppendorf 5810 R;手持糖度計(jì) 日本ATAGO公司PAL-1;分析研磨機(jī) IKA A11;分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司722N;色差計(jì) 美國(guó)hunter lab colorflex;物性分析儀

美國(guó)Food Technology Corporation公司TMS-PRO;真空干燥箱 上海智城分析儀器制造有限公司ZKD-A6270;凍干機(jī) 深圳艾斯蘭德冷機(jī)制造有限公司VL-2W。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 谷胱甘肽浸泡處理 將懷枝去皮去核后，果肉一分為二，采用1mmol/L的谷胱甘肽溶液浸泡懷枝果肉，浸泡時(shí)間為 5、10、15、20、30min。浸泡之后瀝干表面水分迅速進(jìn)行1.2.5的操作。

1.2.2 谷胱甘肽、抗壞血酸真空浸泡處理 將懷枝去皮去核后，果肉一分為二，將果肉分別放入1mmol/L的谷胱甘肽溶液和1mmol/L的抗壞血酸溶液中，然后放入真空干燥箱中進(jìn)行抽真空處理，真空度為0.08Mpa，處理時(shí)間分別為 5、10、15、20、30min。取出后瀝干表面水分迅速進(jìn)行1.2.5的操作。

1.2.3 熱燙處理 將懷枝果肉在90℃的熱水中進(jìn)行熱燙，處理時(shí)間為1、3、5、10min。取出之后立即用純水進(jìn)行冷卻降溫，接著瀝干表面水分進(jìn)行1.2.5的操作。

1.2.4 谷胱甘肽和抗壞血酸溶液熱燙處理 配制不同濃度的谷胱甘肽和抗壞血酸溶液，將溶液加熱至90℃，放入懷枝果肉，處理時(shí)間分別為 1、3、5、10min。取出之后立即用純水進(jìn)行冷卻降溫，接著瀝干表面水分進(jìn)行1.2.5的操作。

1.2.5 懷枝果肉PPO及POD的制備 取適量的懷枝果肉浸入液氮中，待完全冷凍后取出，用分析研磨機(jī)將其果肉打碎，準(zhǔn)確稱取10g左右的果肉，用0.1mol/L pH7.0的磷酸緩沖液在4℃下浸提1h，隨后用兩層紗布過(guò)濾至離心管中，4℃ 8000r/min離心15min，上清液即為粗酶液［9］。向粗酶液中添加40%飽和度的固體硫酸銨，靜置1h后再次在4℃下8000r/min離心15min，棄上清液。沉淀用0.1mol/L pH7.0的磷酸緩沖液溶解，并以同樣的緩沖液透析過(guò)夜，透析液在4℃下8000r/min離心15min，取上清液，即得PPO和POD提取液。

1.2.6 PPO活性測(cè)定 參照劉春麗等［9］的方法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定反應(yīng)體系包括1mL 0.1mol/L的鄰苯二酚，1.9mL 0.05mol/L的磷酸緩沖液和0.1mL酶液，在398nm下測(cè)定吸光度值。從酶液加入開(kāi)始計(jì)時(shí)，每30s記錄一次OD值，以最初的直線段斜率計(jì)算酶活。1個(gè)酶活單位定義為在測(cè)定條件下，吸光度值每分鐘增大0.001所需的酶量。酶活平行測(cè)定三次。

式中:D-稀釋倍數(shù);FW-樣品鮮重(g)。

1.2.7 POD活性測(cè)定 參照劉春麗［10］的方法進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)體系包括2.4mL 0.1mol/L pH7.0的磷酸緩沖液，0.1mL 1%的過(guò)氧化氫，0.4mL 1%的愈創(chuàng)木酚和0.1mL的酶液，在470nm下測(cè)定吸光度值的變化。每10s記錄一次，測(cè)定2min內(nèi)的OD值的變化。1個(gè)酶活單位定義為在測(cè)定條件下，吸光度值每分鐘增大0.001所需的酶量。酶活平行測(cè)定三次。

式中:D-稀釋倍數(shù);FW-樣品鮮重(g)。

1.2.8 凍干荔枝的色差及脆度測(cè)定 將荔枝果肉放置于托盤中，在-35℃的凍庫(kù)中進(jìn)行速凍，待荔枝果肉的中心溫度達(dá)-25℃后，再速凍1～2h，然后將荔枝連同托盤一起放入冷凍干燥機(jī)中，冷阱溫度為-50℃，加熱板溫度為最高設(shè)定為50℃［11］。總干燥時(shí)間為18～20h。

將凍干后的樣品先放置在-25℃的凍庫(kù)中冷凍一段時(shí)間，避免樣品因溫度過(guò)高而變粘。取出后用分析研磨機(jī)打碎，樣品倒入透明的測(cè)量杯中，進(jìn)行測(cè)定、讀數(shù)。顏色通過(guò)L(亮度/暗度)、a(紅度/綠度)、b(黃度/藍(lán)度)表示［12］。每個(gè)樣品重復(fù)五次。

采用FTC公司的TMS-Pro物性分析儀對(duì)凍干后荔枝的脆度進(jìn)行測(cè)定［13-14］。測(cè)定時(shí)，荔枝果肉中心向下放置，測(cè)試探頭選擇直徑為25mm的圓柱形探頭。測(cè)定條件為:起始力0.3N，檢測(cè)前速度50mm/mim，檢測(cè)速度100mm/min，下壓距離為8mm。最大斷裂力可以反映樣品的脆度，單位是牛頓(N)。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行分析，ANOVA程序用于方差分析，Bivariate程序用于組間相關(guān)性分析。當(dāng)p≤0.05時(shí)認(rèn)為平均值之間有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制劑浸泡對(duì)兩種酶活性的影響

經(jīng)多位研究人員實(shí)驗(yàn)證實(shí)，谷胱甘肽和抗壞血酸是多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶的有效抑制劑［10，15-16］。本實(shí)驗(yàn)中，先采用最有效的抑制劑谷胱甘肽對(duì)荔枝進(jìn)行浸泡，濃度為1mmol/L。浸泡對(duì)兩種酶活性的影響見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 不同浸泡處理對(duì)荔枝果肉中PPO活性的影響Fig.1 Effect of soaking treatment on PPO activity in lychee pulp

從圖1和圖2中可以看出，谷胱甘肽浸泡可以降低PPO和POD的活性，在浸泡15min之內(nèi)，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，PPO和POD的活性顯著下降，但再延長(zhǎng)時(shí)間，PPO活性之間并無(wú)顯著差異。一般來(lái)說(shuō)，酶活性降至原來(lái)的5%以下，可以認(rèn)為酶失活。而谷胱甘肽浸泡不能使懷枝荔枝果肉中的PPO和POD失活。這可能是由于浸泡只能抑制荔枝果肉表面的酶活，而很難對(duì)內(nèi)部的果肉起作用，即使延長(zhǎng)時(shí)間，抑制劑也很難滲透至整個(gè)果肉。實(shí)驗(yàn)對(duì)0.5、2mmol/L的谷胱甘肽溶液也進(jìn)行了抑制酶活測(cè)定，殘余酶活有所不同但并無(wú)顯著差別，因此未在文章中列出。

圖2 不同浸泡處理對(duì)荔枝果肉中POD活性的影響Fig.2 Effect of soaking treatment on POD activity in lychee pulp

因此，實(shí)驗(yàn)選擇真空浸泡來(lái)處理懷枝果肉。真空浸泡對(duì)酶活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。從圖中可以看出，谷胱甘肽真空浸泡15min之后，PPO和POD活性顯著低于常壓浸泡(p＜0.05)，但同樣不能使酶失活。抗壞血酸溶液真空浸泡可以顯著降低PPO的活性，而對(duì)POD活性的影響較小。總的來(lái)說(shuō)，谷胱甘肽和抗壞血酸真空浸泡同樣不能使酶失活。這主要是因?yàn)槔笾Φ墓饨Y(jié)構(gòu)并不是由一個(gè)個(gè)細(xì)胞組成的，所以即使是真空環(huán)境，抑制劑溶液也很難滲透至整個(gè)果肉。實(shí)驗(yàn)對(duì)0.5、3、5mmol/L的抗壞血酸溶液也進(jìn)行了抑制酶活測(cè)定，殘余酶活并無(wú)顯著差別，因此同樣未在文章中列出。

2.2 熱燙對(duì)兩種酶活性的影響

熱燙是最常用也最實(shí)用的前處理方法。但對(duì)于荔枝來(lái)說(shuō)，還沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行熱燙研究的。實(shí)驗(yàn)采用90℃熱燙來(lái)處理懷枝果肉，熱燙對(duì)酶活的影響見(jiàn)圖3。

圖3 90℃不同熱燙時(shí)間對(duì)兩種酶活性的影響Fig.3 Effect of blanching time on PPO and POD activities at 90℃

從圖3可以看出，POD的活性先隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，后保持不變。當(dāng)熱燙時(shí)間達(dá)3min時(shí)，POD的活性已降至鮮樣的5%以下了，說(shuō)明90℃ 3min可以使POD失活。但對(duì)于PPO來(lái)說(shuō)，熱燙時(shí)間10min之后，活性為鮮樣的23.46%，與熱燙3min之后并無(wú)顯著差別(p＞0.05)。在實(shí)驗(yàn)中，還測(cè)試了熱燙20min后的PPO活性，其數(shù)值仍與熱燙3min之后的殘余酶活接近。這表明懷枝荔枝果肉中的PPO非常耐熱，單純的熱燙處理很難使懷枝果肉中的PPO失活，這與劉春麗等［2］的研究結(jié)果是一致的。

2.3 抑制劑和熱燙聯(lián)合處理對(duì)兩種酶活性的影響

由上述討論可知，抑制劑浸泡和單純熱燙均不能使PPO失活，而90℃熱燙3min就可以使POD失活，因此，考慮如何使荔枝果肉中的PPO失活是預(yù)處理的關(guān)鍵。采用抑制劑和熱燙聯(lián)合，考察不同濃度的抑制劑熱燙對(duì)荔枝果肉中的PPO的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4和圖5。

圖4 不同濃度的谷胱甘肽溶液90℃熱燙對(duì)PPO活性的影響Fig.4 Effect of glutathione solution on PPO activity at 90℃

圖5 不同濃度的抗壞血酸溶液90℃熱燙對(duì)PPO活性的影響Fig.5 Effect of ascorbic acid solution on PPO activity at 90℃

由圖4可知，隨著谷胱甘肽溶液濃度的增大，PPO的活性不斷的降低。當(dāng)谷胱甘肽溶液濃度達(dá)到3.0mmol/L時(shí)，殘余酶活仍大于10%，這意味著PPO并未失活。如果繼續(xù)提高谷胱甘肽溶液的濃度，可能PPO活性會(huì)進(jìn)一步降低，但谷胱甘肽作為一種酶的抑制劑，其價(jià)格遠(yuǎn)高于普通的抑制劑，從成本上來(lái)說(shuō)，繼續(xù)提高其溶液濃度不是合理的選擇。

從圖5可以看出，隨著抗壞血酸溶液濃度的增大，PPO的活性不斷的降低。當(dāng)抗壞血酸溶液濃度達(dá)到0.3%，熱燙時(shí)間達(dá)3min以上時(shí)，殘余酶活低于5%，表明PPO的活性被很好的抑制。因此，可以采用0.3%的抗壞血酸溶液在90℃至少熱燙3min來(lái)抑制荔枝果肉的酶活。孫月娥等［17］研究發(fā)現(xiàn)，采用0.3%的檸檬酸和0.07%的抗壞血酸溶液在75℃下熱燙3min可以很好的抑制金針菇中的PPO活性，可見(jiàn)抑制劑和熱燙結(jié)合確實(shí)是有效地抑制PPO活性的方法。

2.4 熱燙對(duì)凍干懷枝荔枝品質(zhì)的影響

2.4.1 熱燙對(duì)凍干懷枝荔枝色澤的影響 熱燙對(duì)凍干后懷枝的色澤的影響見(jiàn)表1。從表1中可知，未漂燙的荔枝果肉與不同漂燙時(shí)間的荔枝果肉的L值之間無(wú)明顯差異，a值只與漂燙10min的凍干樣品之間存在明顯差異，b值顯著高于所有漂燙凍干樣品，這表明未漂燙樣品黃色的程度要高，事實(shí)上，這個(gè)現(xiàn)象在實(shí)驗(yàn)中可以清楚的看到，未漂燙的凍干荔枝表面明顯偏黃色，這很可能是由于干制前荔枝的酶促褐變導(dǎo)致的。雖然熱燙1min并沒(méi)有完全使酶失活，但熱燙之后立即進(jìn)行速凍和干制，抑制了酶的活性，因此熱燙過(guò)的樣品之間b值無(wú)顯著差異。表1中的數(shù)值是凍干之后未經(jīng)貯藏測(cè)得的，貯藏期間的顏色變化需要通過(guò)進(jìn)一步的貯藏實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。

表1 90℃不同漂燙時(shí)間對(duì)凍干后荔枝顏色的影響Table 1 Effect of blanching time on color of freeze dried lychee pulp

2.4.2 熱燙對(duì)凍干懷枝荔枝脆度的影響 熱燙之后的荔枝果肉更容易凍干，這可能是由于熱燙使荔枝果肉的結(jié)構(gòu)更松散。通過(guò)物性儀的測(cè)定，凍干荔枝果肉的脆度結(jié)果見(jiàn)圖6所示。從圖中可明顯看出，熱燙1、3min的樣品與對(duì)照組荔枝脆度之間無(wú)顯著差異，而熱燙5、10min的荔枝樣品的斷裂力明顯低于對(duì)照樣，斷裂力越小，說(shuō)明樣品脆度越大，因此熱燙5min及以上可以明顯增加凍干懷枝荔枝的脆度。

圖6 不同熱燙時(shí)間對(duì)凍干后懷枝荔枝果肉脆度的影響Fig.6 Effect of blanching time on crispness of freeze dried lychee pulp

3 結(jié)論與討論

1.0mmol/L的谷胱甘肽和抗壞血酸用于浸泡和真空浸泡懷枝果肉均不能使酶失活;90℃熱燙3min以上能夠使POD的活性降至原來(lái)的5%以下;采用0.3%的抗壞血酸溶液在90℃熱燙3min可以使PPO失活。熱燙使凍干后的荔枝色澤更白;最佳的預(yù)處理工藝為0.3%的抗壞血酸溶液在90℃熱燙5min。

PPO和POD是不是凍干荔枝干在貯藏過(guò)程變色的原因，有待于進(jìn)一步的貯藏實(shí)驗(yàn)。在貯藏過(guò)程過(guò)測(cè)定和比較預(yù)處理和未經(jīng)預(yù)處理樣品色澤的變化并測(cè)定酶活及其它指標(biāo)，分析凍干荔枝變色的真正原因。

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