紫玉米苞葉花色苷的純化鑒定及熱穩(wěn)定性分析

王 丹，馬 越，張 超，陳姍姍，趙曉燕

(北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100097)

花色苷是一類主要存在于植物中的水溶性色素，屬類黃酮化合物，是植物的主要呈色物質(zhì)之一［1-3］，具有多種生物活性功能。能夠清除體內(nèi)的自由基［4］，降低氧化酶的活性［5］，降低高血脂大鼠的甘油脂水平，改善高甘油脂脂蛋白的分解代謝，抑制膽固醇吸收，降低低密度脂蛋白膽固醇含量，減輕肝功能障礙和預(yù)防心血管疾病［5-6］，抗氧化、抗突變、抗腫瘤和抗過(guò)敏［7-8］，抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)等功效［9-11］，因此被廣泛應(yīng)用于糖果、果醬、飲料、果汁、保健品等食品工業(yè)及醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域。然而花色苷結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，對(duì)光、熱、pH敏感，尤其是熱處理會(huì)引起花色苷的降解［12］，結(jié)構(gòu)不同的花青素除了顏色上的差異外，功能性質(zhì)也不同，使其在應(yīng)用過(guò)程中受很大限制［13］。紫玉米花色苷的含量高，無(wú)論籽粒還是苞葉均含有大量的花色苷，由于紫玉米栽培適應(yīng)性強(qiáng)，成本低廉，將是我國(guó)未來(lái)花青素產(chǎn)業(yè)的生力軍，特別是紫玉米苞葉，花色苷的提取與分析有利于紫玉米苞葉的廢物利用，然而苞葉中不同種類的花色苷的熱穩(wěn)定性如何，目前沒(méi)有報(bào)道。本文擬通過(guò)紫玉米苞葉花色苷結(jié)構(gòu)的鑒定明確花色苷組成，并通過(guò)柱層析方法制備單體組分，采用熱重儀器分析總花色苷及不同單體的熱穩(wěn)定性，揭示其熱處理中的失重特點(diǎn)，為其在加工應(yīng)用方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

紫玉米苞葉(涿紫一號(hào)) 由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心農(nóng)產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室提供;乙腈、甲醇色譜純，Dima技術(shù)公司;甲酸、三氟乙酸 分析純，汕頭市西隴化工廠有限公司。

UV-3802紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯公司;HPLC 1200 series，IonTrap 6310液質(zhì)聯(lián)用儀 安捷倫公司;BüCHI R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士布奇公司;，ALPHR Z-4 LD PLUS CHRIST真空冷凍干燥機(jī)北京博勵(lì)行儀器有限公司;AKTA explorer層析儀美國(guó)通用電氣;熱重儀 瑞士梅特勒-托利多。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫玉米苞葉花色苷的提取 取紫玉米苞葉10g，用刀切成片狀，置于攪拌機(jī)中粉碎1min。使用提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇水溶液，并用1mol/L的鹽酸將提取溶劑的pH調(diào)為3，料液比為1∶50，提取溫度50℃，提取時(shí)間1h，提取次數(shù)1次。提取結(jié)束后，將提取物進(jìn)行過(guò)濾，其中上清液再放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中60℃旋蒸得到花色苷的粗提取物。

1.2.2 大孔樹(shù)脂純化 Amberlite XAD-7大孔樹(shù)脂預(yù)處理后，填裝在1.6cm×60cm的填裝柱中，將上述粗提物上樣，檢測(cè)波長(zhǎng)為520nm，流速為7mL/min，0.5%三氟乙酸的水沖洗后，采用0.5%三氟乙酸的甲醇洗脫，收集520nm處的吸收峰，45℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到濃縮液，冷凍干燥成干粉備用。

1.2.3 凝膠樹(shù)脂純化 LH-20凝膠樹(shù)脂預(yù)處理后，填裝在1.6cm×60cm的填裝柱中，將上述干粉溶于超純水，上樣量為0.5mL，流速2mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為520nm，0.5%三氟乙酸的水∶甲醇=7∶3的溶液為洗脫液。

1.2.4 液質(zhì)聯(lián)機(jī)鑒定花色苷成分 HPLC設(shè)定的參數(shù)如下:柱子型號(hào):安捷倫 Zorbax SB-AQ 600bar(1.8μm，100 ×3.0mm);柱溫:25℃;流速:0.3mL/min;進(jìn)樣量:3μL;流動(dòng)相A:0.5%的甲酸水溶液;流動(dòng)相B:0.5%甲酸乙腈;洗脫梯度:0～30min，10%～60%B;30～40min，60% ～100%B;40～50min，100% ～10%B;DAD檢測(cè)器:花色苷的定量計(jì)算使用檢測(cè)波長(zhǎng)520nm。

MS設(shè)定的參數(shù)如下:干燥氣溫度為350℃;N2流速為11L/min;噴霧器壓力為30psig;離子掃描范圍為100到2200(m/z)。整個(gè)過(guò)程都是采用的正離子模式。數(shù)據(jù)使用Agilent Chemstation Rev.A.09.01 software(Agilent，Palo Alto，CA)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 不同組分花色苷的熱重分析 將大孔樹(shù)脂純化后的花色苷提取物和凝膠樹(shù)脂純化后得到的三個(gè)組分，取樣 1.5mg，升溫速率 10℃/min，溫度范圍30～200℃。

1.2.6 結(jié)果分析 采用Origin7.5軟件作圖;實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫玉米苞葉的花色苷組成

大孔樹(shù)脂純化后的紫玉米苞葉花色苷提取物干粉溶于超純水，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)機(jī)檢測(cè)后，其520nm處的圖譜如圖1所示。

圖1 紫玉米苞葉中花色苷的液相圖譜Fig.1 HPLCchromatograms of anthocyanidin from purple corn bract

由圖1可知紫玉米苞葉花色苷提取物含有6個(gè)峰，進(jìn)一步質(zhì)譜鑒定各個(gè)峰的結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 紫玉米苞葉花色苷的質(zhì)譜分析Table 1 Ms data of anthocyanidin from purple corn bract

由表1可知，峰1的母離子質(zhì)核比為449，二級(jí)質(zhì)譜碎片離子峰在m/z 287處，是由于失去一分子葡萄糖［M-162］+得到的，m/z 287為矢車菊素，此外根據(jù)液相色譜出峰順序等信息及參考其它文獻(xiàn)［14-15］，推測(cè)其結(jié)構(gòu)為矢車菊-3-O-葡萄糖苷。以此類推，峰2到峰6分別鑒定為天竺葵-3-O-葡萄糖苷，芍藥-3-O-葡萄糖苷，矢車菊-3-(6′-丙二酰-葡萄糖苷)，天竺葵-3-(6′-丙二酰-葡萄糖苷)，芍藥-3-(6′-丙二酰-葡萄糖苷)。與前人研究結(jié)果相似，紫玉米中主要含有矢車菊、天竺葵、芍藥素類的花青素［13-15］，但是研究表明除了上述六種花青素外，還鑒定出矢車菊-3-(6′-乙基丙二酰-葡萄糖苷)，天竺葵-3-(6′-乙基丙二酰-葡萄糖苷)，芍藥-3-(6′-乙基丙二酰-葡萄糖苷)等［14］，可能是紫玉米品種不同所致。

2.2 層析純化制備紫玉米苞葉花色苷單體

紫玉米苞葉花色苷粗提物進(jìn)Amberlite XAD-7大孔樹(shù)脂柱純化，因?yàn)樘恰⒌鞍住⒂袡C(jī)酸等物質(zhì)與大孔樹(shù)脂沒(méi)有吸附性，因此上樣后，先通過(guò)0.5%三氟乙酸的水沖洗掉不結(jié)合的雜質(zhì)，而吸附在大孔樹(shù)脂上的花色苷經(jīng)0.5%三氟乙酸的甲醇進(jìn)行洗脫，收集520nm處的吸收峰，60℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到濃縮液，進(jìn)一步過(guò)凝膠樹(shù)脂LH-20，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可見(jiàn)，經(jīng)凝膠樹(shù)脂純化后，分別得到三個(gè)花色苷組分，進(jìn)一步通過(guò)液質(zhì)聯(lián)機(jī)檢測(cè)鑒定三個(gè)組分的結(jié)構(gòu)。三個(gè)組分的液相圖譜如圖3所示。

由圖3可以看出，第一個(gè)組分是兩個(gè)物質(zhì)的混合物，第二個(gè)組分與第三個(gè)組分均只含有一種物質(zhì)。其中，第二組分液相保留時(shí)間與圖1的峰1同，進(jìn)一步進(jìn)行質(zhì)譜分析(圖4)。由圖4可知，此物質(zhì)的母離子質(zhì)核比為449，二級(jí)質(zhì)譜碎片離子峰在m/z 287，可見(jiàn)其質(zhì)譜信息也與圖1的峰1同，因此，鑒定其結(jié)構(gòu)為矢車菊-3-O-葡萄糖苷。

圖2 LH-20純化后圖譜Fig.2 UV-vis abs of anthocyanin from purple corn bract purified by LH-20

圖3 LH-20純化后的三組分的液相圖譜Fig.3 HPLC chromatograph of anthocyanin from purple corn bract purified by LH-20

同樣的方法鑒定其他組分的結(jié)構(gòu)，第三個(gè)組分的液相保留時(shí)間及質(zhì)譜信息與圖1的峰4同，因此組分3主要為矢車菊-3-(6′-丙二酰-葡萄糖苷)。第一個(gè)組分的兩個(gè)峰的液相保留時(shí)間及質(zhì)譜信息與圖1的峰2和峰3同，鑒定其是芍藥-3-O-葡萄糖苷和天竺葵-3-O-葡萄糖苷的混合物。而經(jīng)LH-20純化后未能收集到天竺葵-3-(6′-丙二酰-葡萄糖苷)，芍藥-3-(6′-丙二酰-葡萄糖苷)。

2.3 不同組分的紫玉米苞葉花色苷熱穩(wěn)定性分析

花色苷的穩(wěn)定性易受溫度的影響，產(chǎn)生熱降解，而食品加工過(guò)程中熱處理是常見(jiàn)工藝環(huán)節(jié)，花色苷的穩(wěn)定性是影響花色苷類產(chǎn)品色澤品質(zhì)的關(guān)鍵。不同結(jié)構(gòu)的花色苷穩(wěn)定性及功能性不同［16］。以上分離出三個(gè)花色苷組分，與總花色苷提取物相比熱穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 (a)組分2的MS圖(b)組分2的MS/MS圖Fig.4 (a)MSprofile of portion 1(b)MS/MSprofile of portion 1

圖5 不同組分花色苷的熱重分析Fig.5 TG curves of anthocyanins purified by Amberlite XAD-7 and LH-20

由圖5可知，組分1和2熱穩(wěn)定性最差，在升溫至83℃時(shí)，發(fā)生降解失重現(xiàn)象;其次是組分3，110℃降解失重;總花色苷最穩(wěn)定，溫度升至118℃時(shí)才熱解失重。觀察其結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，組分1和2為芍藥-3-O-葡萄糖苷、天竺葵-3-O-葡萄糖苷及矢車菊-3-O-葡萄糖苷，所有花色苷沒(méi)有酰基化結(jié)構(gòu);組分3為矢車菊-3-(6′-丙二酰-葡萄糖苷)，含有一個(gè)酰基化結(jié)構(gòu)。總花色苷提取物除了含有上述花色苷外，還含有天竺葵-3-(6′-丙二酰-葡萄糖苷)，芍藥-3-(6′-丙二酰-葡萄糖苷)，存在三種含有一個(gè)酰基化結(jié)構(gòu)的花色苷。可見(jiàn)酰基化結(jié)構(gòu)越多，熱失重溫度越高，酰基化對(duì)花色苷熱降解失重具有保護(hù)作用。這與前人的研究結(jié)果相似，Shimizu等［17］研究表明，酰化基團(tuán)與發(fā)色基團(tuán)間有較強(qiáng)的作用，使花色苷色素穩(wěn)定性高。此外本課題組研究表明酰基化花色苷不僅穩(wěn)定性強(qiáng)，其結(jié)合DNA、保護(hù)DNA的能力也越強(qiáng)［18］，這些結(jié)果均為花色苷的加工工藝的選擇及功能性的開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

采用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)，鑒定紫玉米苞葉中存在六種花色苷，經(jīng)大孔樹(shù)脂、凝膠樹(shù)脂分離純化后得到三個(gè)組分，第一個(gè)組分為芍藥-3-O-葡萄糖苷和天竺葵-3-O-葡萄糖苷的混合物，第二個(gè)組分為矢車菊-3-O-葡萄糖苷，第三個(gè)組分為矢車菊-3-(6′-丙二酰-葡萄糖苷)。其中含有酰基化花色苷的組分三熱穩(wěn)定性強(qiáng)于沒(méi)有酰基化結(jié)構(gòu)的組分一和組分二。

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