超聲輔助半仿生法提取半邊蓮黃酮苷及抗氧化性研究

黃秀香，韋漢龍，盤玉芬

(河池學院化學與生命科學系，廣西宜州546300)

半邊蓮(Lerba Lobelia Chinensis)為桔梗科植物半邊蓮的帶根全草，半邊蓮含生物堿、黃酮苷、皂苷、氨基酸、果聚糖等成分，具有利水、消腫、解毒等功效，可治療黃疸、水腫、臌脹、泄瀉、痢疾、蛇傷、疔瘡、腫毒、濕疹、癬疾、跌打扭傷等癥［1］。超聲波具有加速藥材中有效成分溶解、縮短提取時間、提高有效成分的提取率等優點［2］。半仿生提取法是從生物藥劑學的角度將整體藥物研究法與分子藥物研究法相結合，模仿口服藥物在胃腸道的轉運過程，采用選定p H的酸性水和堿性水，依次連續提取得到含指標成分高的活性混合物的中藥和方劑的藥效物質提取的方法［3］。論文采用超聲波協同半仿生法對半邊蓮黃酮苷提取工藝進行優化及抗氧化性研究，為半邊蓮的藥物及抗氧化作用研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

半邊蓮 購自宜州市中藥市場，產地廣西宜州;蘆丁對照品 中國藥品生物制品檢定所，純度98%;無水乙醇、氫氧化鈉、九水合硝酸鋁、亞硝酸鈉、石油醚(60～90℃)、醋酸鉛、三氯化鋁、碳酸鈉、濃鹽酸、磷酸氫二鈉、檸檬酸、硫酸亞鐵、三羥基氨基甲烷、鄰苯三酚、磷酸鹽緩沖液、水楊酸、活性炭、H2O2、抗壞血酸、鎂粉、堿式醋酸鉛 均為分析純。

UV-2501紫外分光光度計 日本島津公司;AR224CN型電子分析天平 奧豪斯儀器有型公司;KQ2200DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;FW100型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;PHS-25型數顯pH計 上海精密科學儀器有限公司;SHB-III循環水式多用真空泵鄭州長城科工貿有限公司;低速臺式大容量離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 半邊蓮預處理 將干燥的半邊蓮粉碎，過40目篩后得到半邊蓮粉末，取100g半邊蓮粉末加入400m L石油醚(60～90℃)脫脂2h，抽濾，放置自然風干得到脫脂樣品作為后續提取工藝的樣品。

1.2.2 黃酮苷的提取方法 準確稱取該樣品1.0000g，用乙醇水溶液作為提取劑，模擬胃腸道pH進行提取。用磷酸氫二鈉-檸檬酸的緩沖溶液-鹽酸調pH，在40℃下，設定料液比及不同的超聲功率和超聲時間，改變溶液 pH 分別為2、7.5，提取［4］。合并兩次提取液，加活性炭脫色，抽濾，用同濃度的乙醇定容，待測。

1.2.3 黃酮苷的含量測定［5］精確稱取10.3000mg蘆丁，置于燒杯中完全溶解，轉移至100m L的容量瓶中，用60%乙醇定容。取蘆丁標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0m L于10m L的具塞比色管中，分別加入5%NaNO2溶液0.3m L，搖勻，放置6m in后，分別加入濃度10%Al(NO3)3溶液0.3m L，搖勻，再放置6m in后，再分別加入10%NaOH溶液4m L，用60%的乙醇定容到10m L刻度，搖勻，放置10m in后，采用空白試劑參比，在510nm處測吸光度，繪制蘆丁標準工作曲線。精確吸取待測樣液1m L于10m L具塞比色管中，按此方法測其吸光度，計算其含量。

黃酮苷含量=C×V1×V2/(m×V3)

式中:C-蘆丁標準濃度mg/m L;V1-稀釋的體積m L;V2-定容的體積m L;V3-取樣體積m L。

1.2.4 黃酮苷的還原力測定［6］取5支10m L具塞比色管，分別加入不同質量濃度半邊蓮提取液1m L，再加入2.5m L(pH6.6)0.2mol/L磷酸緩沖液及2.5m L含1%鐵氰化鉀溶液，50℃水浴20m in后急速冷卻，加入含2.5m L 10%三氯乙酸水溶液，離心，取上清液2.5m L，加2.0m L蒸餾水及0.5m L含0.1%三氯化鐵溶液，混勻，靜置10m in后在700nm處測定吸光度。以蒸餾水作參比，VC為陽性對照。

1.2.5 黃酮苷清除羥自由基的測定［7］取6支10m L具塞比色管編號，分別加入2mmol/L FeSO4溶液2m L，6mmol/L水楊酸溶液2m L，已知質量濃度的黃酮苷提取液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0m L，加 1mmol/L H2O22m L，定容至10m L，搖勻后，于37℃水浴中加熱15m in后取出，以蒸餾水為參比，在510nm處測吸光度(A1)。每個處理重復3次。同時用蒸餾水代替雙氧水時測得本底吸收吸光度A2。以蒸餾水作參比，VC為陽性對照。

清除率(%)=［A0-(A1-A2)］/A0×100

式中:A0-空白對照液吸光度;A1-樣品液吸光度;A2-不加H2O2的樣品液的吸光度。

1.2.6 黃酮苷清除超氧自由基的測定［7］取6支10m L具塞比色管，分別加入 Tris-HCl緩沖液(50mmol/L，pH8.2)4.5m L、蒸餾水 2.2m L，置于 25℃水浴中保溫20min;1號為空白管加入10mmol/L HCl 0.3m L、蒸餾水2m L，其余5支試管分別加入25mmol/L的鄰苯三酚溶液0.3m L(以10mmol/L HCl配制)、不同濃度的提取液2m L，混勻后于25℃水浴中反應5m in。以Tris-HCl緩沖液作參比，在320nm處測定吸光度，計算清除率。重復三次實驗，取平均值。以蒸餾水作參比，VC為陽性對照。

式中:A0-空白的平均吸光度;A1-試樣的平均吸光度。

1.2.7 超聲波輔助半仿生法提取半邊蓮黃酮苷工藝條件優選 影響黃酮苷含量的主要因素:乙醇體積分數、料液比、超聲功率、超聲時間。

通過單因素實驗，選擇乙醇體積分數為60%～80%，料液比為 1∶20～1∶40，超聲功率在 60～80W 之間，超聲時間為20～30min。采用L9(34)正交實驗方案，實驗因素水平設計方案見表1。

表1 正交實驗因素及水平Tabel1 Factors and levels in orthogonal array design

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

按照蘆丁對照品濃度梯度與對應的吸光度繪制標校準曲線，得回歸方程:A=7.8225C+0.0054，R2=0.9993，式中:A為吸光度值，C為蘆丁的濃度(mg/mL)。

2.2 黃酮苷的鑒別

鹽酸-鎂粉實驗:取乙醇提取液1m L，加入濃鹽酸4～5滴及少許鎂粉，在沸水浴上加熱3m in，呈現紅色，表明有游離黃酮類或其苷類。

醋酸鉛沉淀實驗:取乙醇提取液2m L，滴加醋酸鉛飽和溶液，有黃色沉淀，繼續加至無沉淀時離心取其上層清液，再用堿式醋酸鉛實驗，觀察有黃色沉淀產生。實驗兩次都有黃色沉淀產生，說明有游離黃酮類或其苷類。

2.3 半邊蓮黃酮苷提取最佳工藝條件及極差分析

超聲波輔助半仿生法提取半邊蓮黃酮苷正交實驗結果及極差分析，見表2。

表2 正交實驗設計及結果Table 2 Orthogonal array designmatrix and experimental results

從表2可以看出，各因素對提取效果影響的主次順序為料液比＞乙醇體積分數＞超聲時間＞超聲功率。最佳提取條件為A2B3C2D2，即乙醇體積分數為70%，料液比1∶40，在40℃超聲功率為70W下，超聲時間25min。通過驗證實驗，測得黃酮苷的含量為4.6975mg/g。

2.4 黃酮苷還原力作用

由圖1可知，在28～140μg/g范圍內，隨著黃酮苷、VC質量濃度的增大，還原力逐漸增強，當質量濃度為56μg/g，黃酮苷吸光度為0.294，VC吸光度為0.32，證明半邊蓮中黃酮苷在一定的濃度范圍內有較好的還原能力，但比VC稍差。

圖1 半邊蓮黃酮苷的還原力Fig.1 Reducing power of flavonoid glycoside from Herba Lobelia Chinensis

2.5 黃酮苷羥自由基的清除作用

由圖2可以看出，半邊蓮黃酮苷對羥自由基的清除能力在一定的濃度范圍內隨著黃酮苷質量濃度的增加而增強，具有一定的量效關系。半邊蓮黃酮苷對羥自由基的 IC50為 42.2μg/g，VC的 IC50為35.6μg/g，半邊蓮黃酮苷對羥自由基的清除能力小于VC。

圖2 半邊蓮黃酮苷對羥自由基的清除作用Fig.2 Hydroxyl radical scavenging effect of flavonoid glycoside from Herba Lobelia Chinensis

2.6 黃酮苷超氧自由基的清除作用

由圖3可以看出，半邊蓮黃酮苷對超氧基自由基有明顯的清除作用，在0.5～2.5μg/g隨著濃度的增加，其對超氧自由基的清除能力增強，即兩者之間存在量效關系。半邊蓮黃酮苷對超氧自由基的IC50為1.4μg/g，VC的 IC50為 1.3μg/g，半邊蓮黃酮苷對超氧自由基的清除能力略低于VC。

圖3 半邊蓮黃酮苷對超氧自由基的清除作用Fig.3 Superoxide anion radical scavenging effect of flavonoid glycoside from Herba Lobelia Chinensis

3 結論

研究結果表明，以磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液為提取液，運用仿生法原理對半邊蓮黃酮苷進行超聲波輔助提取是可行的。因為半仿生法可以提取和保留更多的有效成分，得到含藥理指標高的活性混合成分［8］，而超聲輔助能夠提高提取效率、省時，是一種行之有效的提取方法。通過正交實驗得出:在此方法作用下提取半邊蓮中黃酮苷的最佳工藝條件為體積分數為70%的乙醇，料液比1∶40，在40℃超聲功率為70W下，超聲提取25min，測得黃酮苷含量為4.6975mg/g。

通過對羥自由基和超氧陰離子自由基清除作用的研究發現，半邊蓮黃酮苷對這兩種自由基的清除作用隨著濃度的增加而增大，呈明顯的量效關系，具有一定的清除作用，在實驗所選濃度范圍內，還原能力隨濃度增加而增強，是一種天然有效的抗氧化劑。

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