重組原核表達載體p QE－30－luxS的構建與表達

趙日紅，孟祥晨，* ，滿麗莉，2

(1.東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030;2.黑龍江農業經濟職業學院，黑龍江牡丹江157041)

luxS基因是大多數細菌基因中相對保守的一段序列，編碼產物LuxS是AI-2合成的關鍵酶。Fuqua等首次提出“群體感應”這個術語，用其來描述細菌細胞特定形式的分子交流［1］，并把群體感應系統涉及的一種通用信號分子稱為AI-2。現已發現50多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌［2］具有luxS的同源序列，且同源性很高，分泌的信號分子AI-2結構相似，LuxS/AI-2介導的種群間群體感應系統是最常見的一種群體感應系統。在不同的細菌中，LuxS/AI-2介導的種群間群體感應系統調控細菌的生理生化功能不同。在溶血性大腸桿菌中，luxS基因的突變導致AI-2合成量減少，使Ⅲ型分泌系統表達量降低［3］。在變異鏈球菌中LuxS/AI-2調控其對酸、氧化等壓力的耐受以及細菌素的合成［4］。伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、中間鏈球菌(Streptococcus intermedius)等細菌都可以不同程度的表達LuxS蛋白并合成信號分子AI-2，從而對細菌毒力牙菌斑的形成發揮重要的調控作用［5-6］;大腸桿菌也被證實可以表達LuxS蛋白并合成高活性AI-2［7-8］。大腸桿菌是目前研究深入并被廣泛使用的原核蛋白表達系統，主要優勢是容易培養且易于控制基因表達，可以獲得較高產量的目的蛋白。本項目組前期研究證明植物乳桿菌KLDS1.0391細菌素的合成受群體感應系統調控，本研究主要利用大腸桿菌原核表達系統表達LuxS蛋白，為進一步研究AI-2如何調節植物乳桿菌KLDS1.0391的細菌素合成提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

測序載體p MD18-T simple(含有氨芐青霉素抗性基因)、植物乳桿菌KLDS1.0391、大腸桿菌JM109本實驗室保存;表達質粒p QE-30 黑龍江省八一農墾大學郭東華老師惠贈;大腸桿菌M15感受態細胞 上海顯益化學科技有限公司;MRS培養基 用于植物乳桿菌KLDS1.0391液體以及固體培養;LB培養基 用于大腸桿菌JM109和M15液體以及固體培養;PrimeSTARHS DNA Polymerase、限制性內切酶HindⅢ(15U/μL)、KpnⅠ(10U/μL)、T4DNA Ligase、蛋白分子量標準(低)、瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒

TaKaRa公司;細菌基因組提取試劑盒、質粒小提取試劑盒、DNA片段純化試劑盒 購自天根生化科技有限公司;卡那霉素(Kana)、氨芐青霉素(Amp)，二硫蘇糖醇(DTT) 購自哈爾濱鑫豐生物材料有限公司;IPTG 購自哈爾濱賽拓生物科技有限公司;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍R-250、SDS、Tris Sigma公司;其他試劑 國產分析純;PCR引物

根據植物乳桿菌KLDS1.0391的luxS基因序列用Primer5.0軟件設計用于大量擴增目的基因的引物，上 游 引 物 P1:5′-GGGGTACCATGGCTAAA GTAGAAAGTT-3′，下游引物 P2:5′-CCCAAGCTT CTATTCAACGACTTTGCGT-3′，其中在上下游引物中分別增加KpnⅠ和HindⅢ酶切位點(下劃線部分)，由上海生工生物技術服務有限公司合成。

UVP凝膠成像系統儀 美國UVP公司;GL-21M高速冷凍離心機 上海市離心機械研究所;蛋白電泳儀 美國Bio-Rad公司;ZHWY200B型全溫度恒溫培養搖床 上海智城分析儀器制造有限公司;CHB-100恒溫金屬浴 杭州博日科技有限公司。

1.2 實驗方法

pQE-30-luxS重組質粒構建的技術路線圖如圖1。

圖1 pQE-30-luxS重組質粒的構建Fig.1 Construction of the recombinant prokaryotic vector pQE-30-luxS

1.2.1 目的基因的擴增及純化 以植物乳桿菌KLDS1.0391基因組DNA為模板，用引物P1和P2擴增luxS基因。PCR擴增體系為50μL，反應體系為:上下游引物(10μmol/L 2μL，DNA 模板1μL，5 ×PCR緩沖液(含 Mg2+)10μL，dNTP(各 2.5mmol/L)4μL，PrimeSTARHS DNA Polymerase 0.5μL， dd H2O 30.5μL)。PCR反應過程如下:94℃預變性 3min，94℃變性30s，63℃退火45s，72℃延伸90s，共循環35次，72℃再延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收獲得目的基因。

1.2.2 目的基因與測序載體連接及轉化 由于PrimeSTAR HS DNA Polymerase擴增出的PCR產物為平末端，為連接PCR產物與載體p MD18-T simple，需在PCR產物3′端加A。3′端加A并純化后的目的片段和載體pMD18-T simple按摩爾比10∶1混合，16℃過夜連接，構建重組質粒 pMD18-T simpleluxS，轉化到E.coliJM109中。

1.2.3 重組質粒p MD18-T simple-luxS的篩選及鑒定 挑取單個菌落，以菌體為模板，P1/P2為引物進行菌落PCR鑒定。挑取正確菌落于含有60μg/mL Amp的LB培養基中，37℃下100r/min振蕩過夜培養，提取重組質粒并用KpnⅠ和HindⅢ進行酶切鑒定。將鑒定正確的陽性克隆菌液送往北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，測序結果與正確的基因序列進行比對。

1.2.4 目的基因與表達載體連接與轉化 提取重組質粒 pMD18-T simple-luxS，以KpnⅠ和HindⅢ進行分步酶切，回收luxS基因。再與經過雙酶切的表達載體p QE-30按摩爾比10∶1混合，16℃過夜連接，構建重組表達質粒pQE-30-luxS，轉化到E.coliM15中。

1.2.5 重組表達質粒p QE-30-luxS的篩選及鑒定挑取單個菌落為模板，P1/P2為引物進行菌落PCR鑒定。挑取正確菌落于含有100μg/mL Amp和25μg/mL Kana的LB液體培養基中，37℃ 100r/min過夜培養，提取重組質粒用KpnⅠ和HindⅢ進行酶切鑒定。將鑒定正確的陽性克隆菌液送往華大基因測序，測序結果與正確的基因序列進行比對。

1.2.6 重組LuxS蛋白的誘導表達及SDS-PAGE分析［9-10］將含有重組質粒pQE-30-luxS的E.coliM15單克隆接種到含有100μg/mL Amp和25μg/mL Kana的LB培養基中，37℃ 100r/min過夜培養。取過夜培養物200μL加入到1800μL LB培養基中，并使Amp和 Kana的終濃度為 100μg/mL和 25μg/mL，37℃振蕩培養約1h(OD600=0.4～0.6)，加入1mmol/L IPTG誘導，37℃振蕩培養3.5h，期間每半小時取樣一次，離心收集菌體，PBS洗滌菌體2次，以未誘導樣品為空白對照，進行SDS-PAGE電泳，并用考馬斯亮藍R-250染色液進行染色分析。

2 結果與分析

2.1 luxS基因的擴增

以植物乳桿菌KLDS1.0391的luxS基因序列為模板，用引物P1和P2進行PCR擴增，產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，擴增出的DNA片段在約500bp處形成單一的條帶(圖2)，與預計片斷大小一致。

2.2 PCR產物純化

為滿足后續酶切反應的要求，PCR產物經膠回收純化，再經3′端加A并純化后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得與PCR產物大小一致的單一目的條帶(圖3)。

圖2 目的基因的PCR擴增結果Fig.2 PCR amplication of the target gene

圖3 目的基因PCR產物的純化Fig.3 Purification of PCR products of the target gene

2.3 重組質粒p MD18－T simple－luxS的鑒定

純化后的目的基因與測序載體pMD18-T simple過夜連接，連接產物轉化到E.coliJM109中，通過含有60μg/mL Amp的LB平板篩選陽性克隆，發現抗性平板上長出少量單菌落(圖4)。

圖4 重組轉化子pMD18-T simple-luxS的篩選Fig.4 Screening for the combinated strain with plasmid pMD18-T simple-luxS

隨機挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，結果表明:PCR產物大小與目的基因一致，約500bp(圖5)。

提取質粒并用KpnⅠ和HindⅢ進行分步酶切鑒定。由于線性p MD18-T simple大小約為2700bp，目的基因約500bp，重組質粒的理論長度約3200bp(圖6)。如圖7所示，酶切獲得兩條正確的目的條帶，說明重組質粒正確，連接轉化成功，獲得重組克隆質粒pMD18-T simple-luxS，并將重組質粒送往華大基因進行測序。本課題前期對植物乳桿菌KLDS1.0391的luxS基因已進行測序，且在GenBank上的序列號為HQ704889，重組質粒p MD18-T simple-luxS的測序結果與已知序列相似度達100%(比對結果略)，完全相同，因此判斷重組質粒構建成功。

圖5 陽性克隆的PCR鑒定Fig.5 PCR identification of positive clones

圖6 KpnⅠ第一步酶切結果Fig.6 Enzyme digestion result of pMD18-T simple-luxSby KpnⅠ

圖7 HindⅢ第二步酶切結果Fig.7 Enzyme digestion result of pMD18-T simple-luxSby HindⅢ

2.4 重組表達質粒pQE－30－luxS的構建

表達質粒p QE-30經KpnⅠ和HindⅢ雙酶切后，酶切產物進行膠回收，結果如圖8所示。將重組質粒pMD18-T simple-luxS分步酶切后回收luxS基因，將兩種回收產物過夜連接。

連接產物轉化到E.coliM15中，通過含有100μg/mL Amp和25μg/mL Kana的LB平板篩選陽性克隆。如圖9所示，平板上長出少數單菌落。挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，結果見圖10。

提取質粒，用KpnⅠ第一步酶切，得到目的片段約4000bp，與預計相符，然后用HindⅢ進行第二步酶切，獲得大小分別約為3500bp和500bp的兩個目的片段，結果如圖11所示。將鑒定正確的菌液送往華大基因測序，測序結果與已知序列(GenBank序列號為HQ704889)相似度達到100%，完全相同，因此判斷重組質粒構建成功。

圖8 質粒pQE30雙酶切結果Fig.8 Identification of restrict product of pQE-30

圖9 重組轉化子pQE-30-luxS的篩選Fig.9 Screening for the combinated strain with plasmid pQE-30-luxS

圖10 陽性克隆的PCR鑒定Fig.10 PCR identification of positive clones

圖11 重組質粒酶切鑒定結果Fig.11 Recombinant plasmid and identification of two enzyme digestion

2.5 luxS基因表達產物的SDS－PAGE鑒定

含pQE-30-luxS的E.coliM15于37℃經100r/min振蕩培養1h后，加入1mmol/L的 IPTG誘導，誘導3.5h后進行SDS-PAGE，結果如圖12所示。重組菌泳道增加一條約17.4ku的蛋白條帶，隨著誘導時間的延長蛋白表達量越多，與LuxS蛋白大小吻合，而未誘導菌在此處無誘導表達條帶。

圖12 表達產物SDS-PAGE電泳鑒定Fig.12 Identification of recombinant expressed protein by SDS-PAGE

3 討論

luxS基因普遍存在且同源性很高，編碼的蛋白對AI-2的合成起重要的催化作用。研究發現在體外可以用純化的 LuxS蛋白和Pfs蛋白催化 SAH(S-腺苷高半胱氨酸)產生高 活性的 AI-2［11］。Schauder等擴增E.coliMG1655中的luxS基因和pfs基因，并與表達載體pGEX-4T-1連接，成功表達LuxS蛋白和 Pfs蛋白，并體外合成 AI-2［12］。Sperandio等擴增E.coliMG1655的luxS基因和pfs基因，并與表達載體pQE-30連接，成功表達LuxS蛋白和Pfs蛋白，合成高效的AI-2［13］。Li等擴增表皮葡萄球菌的luxS基因和pfs基因，應用表達載體pQE-9和pGEX-4T-1分別表達LuxS蛋白和Pfs蛋白，并體外合成AI-2［14］。以上文獻通過測定AI-2的生物活性發現，單獨LuxS蛋白或Pfs蛋白與SAH作用，AI-2生物活性不明顯，但二者同時與SAH反應后可產生高活性的AI-2，說明LuxS蛋白和Pfs蛋白是合成AI-2的關建酶，具有重要的生物活性。pQE表達系統是一種可以高效表達和純化外源蛋白的系統。本研究同時考慮植物乳桿菌KLDS1.0391的luxS基因序列和載體上存在的酶切位點，最終選擇表達載體為pQE-30，且載體宿主細胞為E.coliM15。由于限制性內切酶KpnⅠ和HindⅢ的酶切緩沖液不一樣，而使用通用的緩沖液對重組質粒p MD18-T simple-luxS進行雙酶切，不能有效獲得目的片段，所以本研究采用分步酶切法獲得luxS基因，結果成功地獲得了重組蛋白。

4 結論

本研究利用克隆載體pMD 18-T simple與luxS基因連接，再利用兩種限制性內切酶KpnⅠ和HindⅢ對重組質粒進行酶切，回收獲得目的片段，并將其插入到表達載體p QE-30中，轉化重組質粒到E.coliM15，經Amp和Kana抗性平板篩選，再經菌落PCR鑒定、酶切鑒定和測序鑒定，成功構建了p QE-30-luxS原核表達體系，并在大腸桿菌中獲得表達。重組LuxS蛋白分子質量大小與預期一致，為17.4ku。

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