響應面設計法優化花生分離蛋白酶解條件的研究

董新紅，趙謀明，蔣躍明，阮貴華，李海云

(1.桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西桂林541004;2.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640;3.中國科學院植物資源保存與可持續利用重點實驗室，中國科學院華南植物園，廣東廣州510650)

花生是全球最重要的四大油料作物之一。我國花生種植面積逐年遞增;產量已超1500萬t，位居世界第一位［1］。目前國內的花生主要用于榨取食用油。榨油后產生的脫脂花生粕仍含有豐富的蛋白質(50%～55%);但是由于其功能特性不良而難以直接用于食品工業［2］。因此，有必要從脫脂花生粉中開發新的蛋白產品如花生分離蛋白作為一種植物高蛋白資源(蛋白質含量可達90%以上)而加以利用。在花生制油過程中所采用的壓榨或者浸出方法，由于預處理需要對花生原料進行蒸炒、壓坯的過程;因此，受溫度和壓力等因素影響而造成部分蛋白質變性。蛋白質變性后導致水溶性降低、氨基酸降解和組成改變，從而降低蛋白質營養價值［3］。由于各種花生蛋白高端產品對其原料蛋白都有較高的專用功能性要求，所以在應用時其功能特性較難兼容，必須通過改性技術拓寬其應用范圍［4］。花生蛋白的酶解改性具有溫和、高效、專一性強等多項優點，且花生蛋白水解產物具有風味良好，色澤較淺，水溶性好等特性也能滿足食品加工的理想要求［5］。本研究采用響應面設計對花生蛋白的最佳酶解條件進行了研究，可為花生分離蛋白的可控酶解和改性技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高溫榨油后的花生粕 粉碎機粉碎后過120目篩備用，山東魯花公司提供;實驗中所用氫氧化鈉、鹽酸 均為分析純;木瓜蛋白酶(1.3×104U/g) 購于廣州裕立寶生物科技公司;Alcalase 2.4L(3.14×104U/mL)、Flavourzyme(1.2 ×104U/g)、Protamex(1.0×105U/g) 購于Novozymes(諾維信)公司。

粉碎機DFT-50 浙江凌達機械公司;CR 22G高速離心機 日本日立;PHS-3C p H計 上海精科雷磁;DF-1集熱式磁力攪拌器 金壇市新一佳儀器廠;KDN-2C凱氏定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;XMTD-204恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司;FDU-2100冷凍干燥機 日本EYELA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 堿溶酸沉法提取花生分離蛋白［6］稱取一定量的花生粕，按照料液比為1∶8，用1mol/L的 NaOH調p H為10，浸提溫度為60℃，浸提時間為60min，在磁力攪拌水浴鍋中浸提。攪拌浸提后于3000×g、5℃下離心10min，收集上清液，用1mol/L HCl調pH為4.5，然后在3000×g、5℃下離心10 min，收集沉淀后用去離子水溶解，經1mol/L NaOH調溶液pH為7.0，最后冷凍干燥即得花生分離蛋白。

1.2.2 花生蛋白酶解條件的優化實驗

1.2.2.1 酶解工藝的確定 按照1.2.1提取得到的花生分離蛋白，配成5%蛋白溶液，按照表1中最適比例加入酶液，攪拌水解120min，然后將酶解液置沸水浴中加熱滅酶，冷卻后于3000×g、4℃下離心20min，得到的上清液即為酶解液，進行冷凍干燥。

表1 幾種蛋白酶的作用參數Table 1 Operational conditions for proteases

1.2.2.2 花生分離蛋白水解酶的作用評價 選擇Alcalase、Flavourzyme、Promatex和 Papain 四種酶按上述流程對花生分離蛋白進行單酶酶解，以水解度為考察指標來比較不同酶的水解效果。根據預實驗中觀察到的不同酶的水解特性差異，對 Alcalase和Promatex水解采用 pH-stat法計算水解度，而Flavourzyme和Papain水解采用甲醛滴定法測定水解度。

PH-stat法:按照1.2.2.1的酶解流程，在水解過程中，用磁力攪拌器緩慢攪拌，在反應過程中通過加入1mol/L的NaOH溶液維持pH在8.00±0.02范圍內，根據需要記錄相應的反應時間內堿液的消耗量。根據以下公式計算水解度［7］:

DH(%)=h/htot×100

h=B ×Nb×(1/Mp)×(1/α)

α =10(pH-pK)/［1+10(pH-pK)］

式中，B:酶解反應中保持p H恒定消耗的堿量，mL;Nb:NaOH的摩爾濃度，mol/L;Mp:底物中蛋白質總量，g;htot:蛋白中肽鍵總數(可根據蛋白質的氨基酸組成計算)，mmol/g(htot對于某一特定的蛋白質來講是一個常數，花生蛋白質的htot=7.13 mmol/g);α:α-NH2的平均解離度，它是反應溫度的函數;p K為α-氨基酸的解離常數，可取7.0進行計算［8］。

甲醛滴定法［9］:取蛋白水解液5 mL于小燒杯中，加入60 mL去CO2的蒸餾水，磁力攪拌并用精密p H計指示p H。先用0.01 mol/L標準NaOH滴定至p H=8.2時，加入已中和好的甲醛溶液20 mL，記錄將其p H滴定至9.2時所消耗的0.1 mol/L NaOH溶液的體積，然后計算出游離氨基氮的含量(g/mL，總氨基氮):

游離氨基氮含量(g/mL)=C×(V-V0)×0.014/5

式中:V為樣品耗用氫氧化鈉標準溶液毫升數，mL;V0為空白耗用氫氧化鈉標準溶液毫升數，mL;C為氫氧化鈉標準溶液濃度，mol/L。

水解度(%)=游離氨基氮/總氮×100。

總氮測定:凱氏定氮法［10］。

1.2.2.3 Alcalase水解花生分離蛋白的單因素分析Alcalase水解花生分離蛋白的單因素實驗基本條件為:酶用量20μL/g、pH8.0、溫度50℃。在5%底物濃度下，改變其中一個條件，同時其它條件不變以分別考察酶用量、pH和反應溫度對水解度的影響。各因素水平梯度分別為:酶用量:20、60、100和140μL/g;p H:6、7、8 和 9;溫度:30、40、50 和60℃。

1.2.2.4 響應面設計對Alcalase對花生分離蛋白酶解工藝的優化 根據Central composite實驗設計原理，綜合單因素實驗結果，選取酶解溫度、酶濃度和p H三個因素，在單因素實驗基礎上，設計三因素三水平的響應面分析方案，因素水平表見表2。

表2 響應面分析與水平編碼表Table 2 Factors and levels of response surface analysis

2 結果與分析

2.1 蛋白水解酶的作用評價

從圖1可以看出，在四種酶中，以Alcalase的酶解效果最好，水解 120min，最大水解度可達到18.02%;其次是復合蛋白酶Promatex(12.47%)，風味酶Flvaourzyme(7.74%)和木瓜蛋白酶Papin(7.01%)。這說明蛋白酶因來源不同、酶學特性不同，對同一種蛋白質的水解作用存在較大差異。另外，由于堿性蛋白酶在花生分離蛋白中的水解能力較強，作用范圍寬，便于控制。因此，其后實驗選用Alcalase作為水解用酶。

2.2 Alcalase水解花生蛋白的單因素分析

圖1 不同酶類水解花生分離蛋白工作曲線Fig.1 Graphs of peanut protein isolates hydrolyzed by four different proteases

2.2.1 起始pH對花生分離蛋白水解的影響 p H是影響酶解效果的重要因素之一。p H對酶促反應的影響機理是多方面的。如強酸或強堿可改變酶空間結構使酶失活;也可以改變底物的解離狀態，影響它與酶的結合從而改變整個酶促反應進行。從圖2來看，在酶濃度為20μL/g、酶解溫度50℃和底物濃度為5%的酶解條件下，隨著反應起始pH的升高，堿性蛋白酶Alcalase對花生蛋白的水解效果增強，說明Alcalase以花生蛋白為底物水解時，其pH的穩定范圍較寬。但是在p H為9和10時，水解度已經非常接近。考慮到起始pH過高，酶解結束后的酶解液在調p H至中性時，會產生太多的鹽分，所以確定p H8作為進一步響應面優化方案的中心點。

圖2 不同pH下Alcalase水解花生蛋白的進程曲線Fig.2 Effects of various pH on peanut protein hydrolysis by Alcalase

2.2.2 不同溫度對花生蛋白酶解的影響 溫度對酶促反應的影響主要有兩方面:一是溫度高低影響蛋白酶的穩定性，若反應溫度超過某一限度，極易引起次級鍵重排，而致使蛋白酶變性喪失或部分喪失催化活性;二是溫度對酶促反應本身的影響，其中可能包括影響酶和底物的結合、反應速率、解離常數(p Ka)、酶與抑制劑、激活劑或輔酶的結合等［11］。從圖3可以看出，在反應前60min內，水解度隨著溫度升高而不斷提高;但是在50和60℃下水解度非常接近，這說明60℃的高溫已經接近適合Alcalase水解花生蛋白的極限，所以表現為在60min后，50℃的水解效果逐漸超過60℃。酶催化反應均有其最適溫度，當溫度上升到一定程度時，酶分子吸收了過多的能量，引起了酶蛋白變性，從而使得酶活性減弱或喪失［12］。圖3 結果顯示，在酶用量 20μL/g、pH8.0 和底物濃度為5%時，以花生蛋白為底物，Alcalase在50～60℃的范圍內活性較強。根據以上分析，選擇50℃作為進一步響應面分析的中心點。

圖3 不同溫度下Alcalase水解花生蛋白的進程曲線Fig.3 Effect of various temperatures on peanut protein hydrolysis by Alcalase

2.2.3 不同酶濃度對蛋白水解的影響 從圖4可知，在p H8.0、溫度為50℃和底物濃度為5%的酶解條件下，酶解反應初期的前60min內，大分子蛋白質迅速減少;但隨著酶濃度的提高，水解度上升很快。酶濃度為140μL/g時水解度遠遠高出低濃度時的水解度。在反應 120min時，所采用的 140、100、60μL/g的酶濃度，三者水解度比較接近;這可能是隨著水解的進行，當大分子蛋白減小到一定程度時，無論體系中酶濃度的高低，其與底物蛋白作用的幾率都大為降低。綜合考慮，選擇100μL/g作為優化實驗的中心點。

圖4 不同酶濃度時Alcalase水解花生蛋白的進程曲線Fig.4 Effect of various enzymatic concentration on peanut protein hydrolysis by Alcalase

2.3 響應面優化酶解工藝參數

2.3.1 二次方程數學模型的建立及最佳化分析 對Alcalase水解花生蛋白的條件進行響應面分析，綜合考慮各因素對花生分離蛋白水解度的影響，采用Design Expert 7.0軟件設計響應面實驗方案，以水解度作為響應指標，建立數學回歸模型，對酶解工藝參數進行最佳化分析，同時反映不同因素間的交互影響。其具體實驗結果見表3。

根據實驗結果建立提取條件與水解度之間的數學模型:DH(%)=-291.82+4.09A+0.44B+38.86C-0.03A2+2.82B2-1.64C2-1.00AB-0.06AC-0.05BC。

當“Prob＞F”值小于0.05即表示該項指標對模型影響顯著。從表4的分析結果來看，整體模型的“Prob＞F”小于0.05，表明該二次方程模型高度顯著;同時，溫度(A)，酶濃度(B)和p H(C)都屬于影響高度顯著的(p＜0.05)。在所選取的各因素水平范圍內，按照對酶解的影響大小排序為:p H＞溫度＞酶濃度。

表3 Alcalase水解花生分離蛋白響應面設計及結果Table 3 Plan and results for Alcalase hydrolysis peanut protein by response surfacemethodology

表4 響應面分析法水解花生蛋白的回歸分析Table 4 Regression analysis for peanut protein hydrolysis by RSM

根據所建立的數學模型進行參數最佳化分析，取得Alcalse酶解花生蛋白水解度最高所需的條件為:反應溫度53.11℃，酶濃度為135.94μL/g，pH 為8.05，預測在該條件下的水解度是24.57%。根據該工藝參數條件實際測得的花生蛋白水解度為24.15%。經計算表明，預測值與實際值之間無顯著差異(p＞0.05)，因此，該預測方程切實可行。

2.3.2 兩因素間的交互作用分析 根據提取條件與水解度之間的二次模型所做的響應曲面圖為圖5～圖7。從圖中可以直觀反映出各因素及其交互作用對水解度的影響。

圖5為酶解溫度與酶濃度間的交互作用。提高酶濃度和反應溫度均能提高花生分離蛋白的水解度。當反應的pH處于中心點時，水解度隨著溫度的升高表現出先升高后降低的趨勢;并且隨著酶濃度升高，水解度也逐漸升高;與酶濃度相比，在40～60℃范圍內，酶解溫度對酶解效果的影響更顯著。

圖5 溫度與酶濃度對Alcalase水解花生分離蛋白的交互影響Fig.5 Interactive effects of temperature and enzyme concentration on DH

圖6 為pH和溫度間的交互作用。當酶濃度固定為中心點不變時，與圖5所示結果一樣，水解度隨著溫度升高呈現先上升后降低的趨勢，而隨著pH增大而升高。與溫度相比，在40～60℃范圍內，pH對酶解效果的影響更顯著。

圖6 pH和溫度對Alcalase水解花生分離蛋白的交互影響Fig.6 Interactive effects of pH and temperature on DH

圖7 為pH和酶濃度的交互作用。底物濃度固定中心點不變時，水解度隨著酶濃度和pH的增大而提高。該結果與之前的單因素實驗結果一致。與酶濃度相比，pH對酶解效果的影響更為顯著。

圖7 pH和酶濃度對Alcalase水解花生分離蛋白的交互影響Fig.7 Interactive effects of pH and enzyme concentration on DH

3 結論

采用中心組合設計及響應面分析，建立了A lcalase水解花生分離蛋白的二次多項式數學模型。經檢驗證明該模型切實可行，能較好地預測花生分離蛋白的水解度。利用模型響應面對影響水解度的各因素及其交互作用進行了分析。Alcalase水解花生分離蛋白的最優工藝參數為:反應溫度為53.11℃、酶濃度為135.94μL/g、pH為8.05、預測蛋白水解度為24.15%，與擬合方程預測結果24.57%基本吻合。

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