出口濃縮果汁中脂環酸芽孢桿菌的分離及相關生物學特性的研究

張宇霞，李 儒

(甘肅出入境檢驗檢疫局綜合技術中心，甘肅蘭州730020)

脂環酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus)，俗稱耐熱菌、嗜酸耐熱菌、耐熱耐酸菌等，Cemy等首次從腐敗的濃縮果汁中分離出一株含ω脂環酸的芽孢桿菌，并且證明該菌是造成巴氏滅菌果汁腐敗的主要原因之一［1］。Wisotzkey 等人［2］根據其堿基對的含量、耐酸與耐熱的特性、16S rDNA序列特性以及細胞膜特有的ω環狀脂環酸，于1992年首次將其從芽孢桿菌屬里分離出來，形成一個新屬，稱為脂環酸芽孢桿菌屬。目前，該菌屬包括17個已知種:A.acidocaldarius，A.acidoterrestris，A.acidiphilus，A.hesperidum，A.sendaiensis，A.vulcanalis，A.tolerans，A.disulfidooxidans，A.cycloheptanicus，A.herbarius，A.pomorum，A.contaminans，A.fastidiosus，A.kakegawensis，A.macrosporangiidus，A.Sacchari，A.shizuokensis;另外還有2個亞種:A.acidocaldarius subsp.Aidocaldarius和A.acidocaldarius subsp.Rittmannii［3］。大多數產芽孢細菌不能在果汁以及其它pH＜4.0的酸性環境中生長繁殖［4］，對酸性食品的殺菌多采用85～95℃巴氏殺菌就能收到了良好的效果。然而，高溫瞬時殺菌不能消除的蘋果濃縮汁產品中，抗逆性極強的脂環酸芽孢桿菌，這將嚴重影響著蘋果濃縮汁產品的品質。中國是蘋果第一大生產國，濃縮蘋果汁也大量出口，為了提升濃縮蘋果汁的品質，就要對其加工過程中脂環酸芽孢桿菌的污染和生長繁殖進行有效地控制，這就必須弄清楚這些脂環酸芽孢桿菌的類型、來源和生理生長特性等，以便采取針對性的措施。截至目前為止，我國對脂環酸芽孢桿菌屬的研究尚處于初步階段。因此，在我國開展該屬新菌種的開發、鑒定，地域分布特性及源于果汁的新菌株的分離鑒定及其特性研究，對有效控制其危害具有十分重要的現實意義。本研究將對濃縮蘋果汁生產線上的洗果水、冷凝水、蘋果清汁、蘋果濃縮汁等樣品中的脂環酸芽孢桿菌進行分離、純化，并對其生物學特性進行研究，以及考察脂環酸芽孢桿菌在生產線上的分布，以便為后續研究提供實驗材料，為生產中脂環酸芽孢桿菌的控制提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Alicyclobacillus acidoterrestris(ATCC 49025)、Alicyclobacillus cycloheptanicus(ATCC 49029)、A.acidocaldarius(ATCC 27009) 美國標準生物品收藏中心(ATCC);蘋果濃縮清汁(pH3.5～4.5、可溶性固形物含量為(71±1)°Brix) 甘肅省內各果汁生產企業;洗果水、浮洗水、沉淀池水 甘肅省內各果汁生產企業。

B6200型電熱恒溫培養箱 德國memmert公司;超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司;臺式電子天平德國賽多利斯公司;紫外分光光度計 美國PE公司;高壓蒸氣滅菌器 MLS3570，日本三洋公司;負壓泵 美國GAST公司;杯式過濾除菌裝置 上海信步科技有限公司;酸度計 德國賽多利斯公司;恒溫振蕩培養箱 SHA-C，常州中捷實驗儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂環酸芽孢桿菌的分離培養

1.2.1.1 分離培養基的制備 按ATCC提供的1656 BAM-SM培養基配方并添加金屬離子溶液配制成分離培養基。CaCl2·2H2O 0.25g、MgSO4·7H2O 0.5g、(NH4)2SO40.2g、KH2PO43.0g、Yeast extract 6g、微量金屬溶液 1mL(CaCl2·2H2O 0.66g，ZnSO4·7H2O 0.18g，CuSO4·5H2O 0.16g，MnSO4·4H2O 0.15g，CoCl2·6H2O 0.18g，H3BO30.10g，Na2MoO4·2H20 0.30g，分別溶于1L滅菌蒸餾水)，加入1000mL滅菌蒸餾水，充分攪拌溶解后用H2SO4調節pH至4.0，121℃高壓滅菌15min，即為1656 BAM-SM液體培養基。若制1656 BAM-SM瓊脂平板，先制備雙倍液體培養基(即同溶液體積中各成分加倍，調p H4.0)和等體積的4%蒸餾水瓊脂，然后為了防止瓊脂被酸化將兩者分別121℃高壓滅菌15min，在無菌條件下將保溫至50℃的雙倍液體培養基和4%蒸餾水瓊脂等體積混合，調pH至4.0后傾注平板，4℃保存備用。

1.2.1.2 樣品來源及采集 樣品采自濃縮蘋果汁生產企業的濃縮蘋果汁成品、濃縮蘋果汁生產中最可能被脂環酸芽孢桿菌污染的主要生產工段，主要包括車間生產用水和設備清洗用水，比如洗果水、浮洗機水、沉淀池水等，無菌取樣后立即送回實驗室進行實驗。

1.2.1.3 脂環酸芽孢桿菌的分離 濃縮蘋果汁脂環酸芽孢桿菌的分離參照文獻［5］的方法，用無菌吸管吸取10mL蘋果汁于90mL無菌蒸餾水的三角燒瓶中稀釋混勻，然后置于(80±1)℃的恒溫水浴箱內處理13min，然后迅速置于冰水浴中冷卻至室溫。冷卻后在無菌條件下使處理液通過裝有孔徑為0.45μm濾膜的過濾器進行抽濾，抽濾完畢后用無菌鑷子將濾膜取下，貼于分離培養基平板上，45℃培養3～5d，待濾膜上長出明顯菌落后直接從濾膜上挑取菌落，轉入斜面培養，經過進一步分離純化后得到純培養的菌株。洗果水、浮洗機水、沉淀池水等生產用水脂環酸芽孢桿菌的分離，用無菌吸管吸取30mL(雜質較多時采用1000r/min低速離心吸取上清)于70mL無菌水的三角燒瓶中稀釋混勻，其余步驟同濃縮蘋果汁脂環酸芽孢桿菌的分離。將分離純化后的菌株-20℃保存備用。

1.2.2 脂環酸芽孢桿菌的生物學特性觀察

1.2.2.1 脂環酸芽孢桿菌的篩選 耐酸特性鑒定實驗:將濃縮蘋果汁和生產用水分離得到的純培養菌株劃線接種于LB平板培養基(pH7.0)，45℃恒溫培養箱培養48h，保留不能在LB平板上生長的菌落［6］。

耐熱特性鑒定實驗:將濃縮蘋果汁和生產用水分離得到的純培養菌株接種于10mL無菌水制成菌懸液，于80℃溫度下熱休克處理13min，再采用涂布法接種于1656 BAM-SM瓊脂平板培養24h，保留可以生長的菌落［5，7-8］。

1.2.2.2 脂環酸芽孢桿菌的細胞形態及菌落特征觀察 對經過耐酸和耐熱特性檢驗的菌株進行細菌和菌落形態的初步觀察。

a.革蘭氏染色:選取培養24h內斜面新鮮菌進行革蘭氏染色處理，處理后進行顯微鏡觀察其細菌形態［9］。

b.芽孢染色:選取培養24～48h斜面新鮮菌進行芽孢染色處理，處理后進行顯微鏡觀察其芽孢形態［9］。

c.菌落特征:將標準菌株Alicyclobacillus acidoterrestris(ATCC 49025)、Alicyclobacillus cycloheptanicus(ATCC 49029)和經過耐酸和耐熱特性以及革蘭氏染色和芽孢染色檢驗的分離菌株分別接種于1656 BAM-SM瓊脂平板培養24～72h，觀察各菌落在培養基上的顏色、形狀、大小等菌落形態。

1.2.2.3 生長條件實驗 p H的確定:采用1mol/L H2SO4和1mol/L NaOH調節1656 BAM-SM固體培養基的 p H 分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，將標準菌株和分離菌株分別接種于不同p H的培養基上，培養2～5d觀察其生長情況，初步確定菌株生長的pH，再將其精確到0.1，每個酸度重復實驗2次。將菌株接種于微調后的不同pH培養基中，培養2～5d觀察其生長情況，最終確定各菌適宜生長的p H。

生長溫度的確定:將標準菌株和分離菌株分別接種于1656 BAM-SM固體培養基上，分別于20、30、40、50、60和70℃培養2～5d，根據初測結果溫度調整各菌的生長溫度范圍，精確到1℃，將各菌株接種于培養基上置于微調后的不同溫度下，培養2～5d，觀察各菌生長情況，確定各菌適宜的生長溫度。

1.2.2.4 生理生化反應特征 過氧化氫酶實驗、氧化酶實驗、明膠液化、V-P實驗、淀粉水解、N源利用實驗、吲哚實驗、脲酶實驗、硝酸鹽還原實驗、檸檬酸鹽利用實驗等均參照文獻［9］的方法進行，為了保證脂環酸芽孢桿菌生長所需要的酸性條件，一般采用蘋果酸酸化的培養基進行以上生理生化實驗，同時利用生物梅里埃的API 50 CH生化反應試劑條進行標準菌株的生理生化實驗。

1.2.2.5 標準菌株及分離菌株生長曲線的確定 分別將標準菌株和分離菌株的45℃、72h單個培養菌落接入100mL 1656 BAM-SM液體培養基中，于45℃溫度下培養，分別在4、8、17、24、32、48、55、72、96h 取液體培養物10mL，測定菌體的吸光值，并同時將該液體培養物1mL經適當稀釋后涂布于1656 BAM-SM固體培養基上，45℃、72h條件下進行培養，然后計數，分別建立標準菌株和分離菌株在45℃溫度下的吸光值與培養時間以及吸光值與菌濃度之間的關系曲線。

表1 各菌株菌落形態觀察結果Table 1 Observation results of colony morphology of different

表2 各菌株細菌形態觀察結果Table 2 Observation results of cellular morphology of different strains

2 結果與分析

2.1 脂環酸芽孢桿菌的分離純化及耐酸耐熱性檢驗

通過對甘肅省內濃縮蘋果汁生產企業的濃縮蘋果汁成品以及濃縮蘋果汁生產中最可能被脂環酸芽孢桿菌污染的主要生產工段，主要包括車間生產用水和設備清洗用水，比如洗果水、浮洗機水、沉淀池水等進行無菌取樣，共采集144個樣品，經過分離、篩選和純化，共得到59株分離菌株。將分離菌株經過80℃溫度下熱休克處理13min，均能很好地生長，表明其有很好的耐熱性;在1656 BAM-SM培養基上生長良好，但在LB培養基上均不能生長，證明其均有嗜酸性。因此可以初步證明本實驗分離到的59株菌為嗜酸耐熱且產生芽孢桿菌。

2.2 脂環酸芽孢桿菌的生物學特性

2.2.1 脂環酸芽孢桿菌細胞形態及菌落形態觀察按1.2.1方法分離培養可以得到大量的耐熱耐酸菌，這些耐熱耐酸菌用通常的細菌檢測方法難以檢出，在45℃條件下常需要2～5d才可以形成明顯的菌落。從各個樣品分離出來的菌株的菌落形態學特征來看，樣品中的耐熱耐酸的脂環酸芽孢桿菌并不是單一形態的菌，而是表現為多形態的產芽孢桿菌。從中挑選出三株有代表性且與標準菌株十分相似的菌株，與標準菌株的菌落形態觀察結果見表1，菌落形態見圖1。由表1可知，分離菌株Ⅰ和分離菌株Ⅱ與標準菌株Ⅱ菌落特征十分相似，乳黃色、圓形、邊緣整齊、表面有褶皺;而分離菌株Ⅲ與標準菌株Ⅰ菌落特征十分相似，乳白色、圓形、邊緣不整齊、表面有少許褶皺，但三株分離菌株的菌落大小均小于標準菌株，只有1～3mm大小。分離菌株與標準菌株的細菌形態觀察如表2和圖2所示，由表2和圖2可知標準菌株和分離株的細菌形態十分相似，均為桿狀;革蘭氏染色均為陽性;各菌運動性的鏡檢法觀察結果表明，各菌均不運動;芽孢位置均為次端生或端生。

圖1 分離株與標準菌株的菌落Fig.1 The colony morphology of standard and isolated bacteria

2.2.2 脂環酸芽孢桿菌生長條件的確定 按1.2.2.3的方法，標準菌株和分離菌株培養的生長實驗結果見表3。由表3可知各菌溫度條件在25～60℃范圍內、pH在2.4～6.8范圍內均能良好生長，從本實驗得到的三株分離菌株與標準菌的生長條件基本相同。從它們的生長溫度和p H范圍可以看出，這些菌株不僅可以耐受酸性條件，并且還表現出對酸性條件的依賴性和嗜好性，均符合脂環酸芽孢桿菌特有的耐酸耐熱的特性。

2.2.3 脂環酸芽孢桿菌生理生化反應結果分析 標準菌株和分離菌株的生理生化反應結果如表4所示。由表4結果可以看出，除分離菌Ⅲ的淀粉水解為陰性、分離菌Ⅱ和分離菌Ⅲ的N源利用為陰性，這兩個特征與標準菌株不同外，其余各項生理生化特征與標準菌株相同。由此可見，3株分離菌株與標準菌株有明顯相似的特征，而出現的差異恰恰可能是由于同屬中不同菌種的差異造成的。

圖2 各菌株顯微鏡形態觀察結果(10×100)Fig.2 Micro-morphology of vegetative form(10×100)

表3 各菌株的生長條件分析結果Table 3 Results of cultural characteristics

表4 各菌株生理生化反應分析結果Table 4 Results of physiological characteristics

2.2.4 各菌株生長曲線結果 標準菌株Ⅱ與分離菌株Ⅱ在45℃溫度培養下吸光值與培養時間以及吸光值與各菌細菌濃度之間的關系曲線圖如圖3所示。由圖3可見，標準菌株與分離菌株的生長趨勢比較一致，單個菌落在100m L 1656 BAM-SM液體培養基中在培養24h后開始進入對數生長期，32h進入穩定生長期，當生長到48h后菌體濁度緩慢降低，進入衰亡期。標準菌和分離菌在溫度為45℃條件下培養48h后的A600為0.6～0.7時，活菌數量可以達到105～107CFU/m L。

3 討論

圖3 標準菌株和分離菌株的生長曲線Fig.3 The growth curve of standard and isolated

根據本實驗室以及分離樣品的實際情況選擇了BAM培養基，并對該培養基進行適當調整，形成了1656 BAM-SM培養基，同時采用膜過濾法，該方法取樣量大，而且能夠截留富集果汁中的絕大多數脂環酸芽孢桿菌，對于分離該菌取得了良好的效果。本實驗的蘋果汁樣品以及車間生產用水和設備清洗用水樣品經過熱處理，會殺滅樣品中某些不能耐受高溫的雜菌，減少了雜菌對培養結果的影響，同時在熱處理過程中芽孢可能被激活，給予適當溫度的處理會使芽孢萌發、繁殖。而分離樣品中的車間生產用水和設備清洗用水由于pH高于濃縮蘋果汁，使得雜菌數量和種類也相對增多，因此經過一定的熱處理就更加必要，而且其中所含雜質較多，在熱處理前經過低速離心以去除水樣中的泥沙等雜質將增快膜過濾速度、減少雜菌污染有著重要的意義。

本研究從144個濃縮蘋果汁和生產用水樣品中，經過分離、篩選和純化，首次得到59株分離菌株，將這59株菌株進行了耐熱耐酸特性的實驗，結果表明其均具有耐熱耐酸的特性，符合脂環酸芽孢桿菌耐熱耐酸的特點，初步表明和脂環酸芽孢桿菌同屬于嗜酸耐熱菌;又將其與標準菌株進行了細菌形態、菌落形態、生長條件以及生理生化反應特性的對比，發現其與標準菌株具有十分相似的特征，但同時也存在著一定的差別，故初步判斷這59株分離菌株和標準菌株同屬于一個屬，但對具體種的劃定尚需進行進一步的研究鑒定。

本研究對于生長曲線的實驗中發現了單個菌落在100m L 1656 BAM-SM液體培養基中在培養24h后開始進入對數生長期，32h進入穩定生長期，當生長到48h后菌體濁度緩慢降低，進入衰亡期，這與文獻中有差異［6-7，10］;以及標準菌和分離菌在溫度為45℃條件下培養48h后的A600為0.6～0.7時，活菌數量可以達到 105～107CFU/m L，這與文獻［11］在 47℃ 條件下培養24～48h A600為0.4～0.7時，活菌數量可以達到107～108CFU/m L也存在差異，這可能與選擇的培養基、培養條件、該菌的不同地域分布特性是否會改變其生長特性等因素有關。對于生理生化特性的研究，有學者利用API CHB/E試劑盒進行糖醇利用實驗的研究［6，12］，而 Pettipher GL［13］則認為 API CHB/E試紙條在37℃和44℃的結果不一致，不適用于鑒定脂環酸芽孢桿菌，在本研究中同時采用傳統方法和APICHB/E試紙條進行了生理生化特性實驗，結果表明APICHB/E試紙條適用于溫度在37℃的嗜溫菌，而溫度提高到45℃以上時，其實驗結果是否可信有待進一步驗證，而且酸化的培養基對于使用API CHB/E試紙條，其結果也不明確;同時API CHB/E試紙條結果的判定是基于顏色的深淺判斷，這對于結果陽性的判斷也帶來難度，帶來不確定性，因此認為API CHB/E試紙條不適用于該菌生理生化特性的研究，是否可以用文獻報道［12］將目標碳源(糖、醇)以2g/L直接加入BAM基礎培養基中培養菌種，每隔7d測量pH來判斷其碳源的利用情況的方法有待進一步研究。

4 結論

脂環酸芽孢桿菌是一種廣泛分布于世界各地，存在于土壤、溫泉、硫磺礦、有機物、肥料、熱加工食品、地熱含水層的水和沉渣等中的革蘭氏陽性芽孢桿菌。研究結果表明，本實驗中的144個濃縮蘋果汁和生產用水樣品，經1∶10稀釋、生產用水3∶7稀釋(雜質較多時采用1000r/min低速離心吸取上清)，(80±1)℃熱處理13min，冰水浴中快速冷卻至室溫，0.45μm膜過濾后將濾膜取下貼于1656 BAM-SM固體培養基平板上，45℃培養3～5d得到了59株分離菌株。將其與標準菌株進行對比，發現其與標準菌株具有相似的培養特性和生理生化特性，可初步判斷為脂環酸芽孢桿菌，但還需進行進一步的鑒定，這將為在我國開展該屬新菌種的開發、鑒定，地域分布特性及源于果汁的新菌株的分離鑒定及其特性研究，對有效控制其危害提供實驗材料，并且還將為后續研究提供實驗依據，為生產環節中脂環酸芽孢桿菌的控制提供指導和依據。

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