響應面法優化Enterobacter sp.SYA2乳糖酶發酵工藝

張衛兵，文鵬程，劉芳寧，艾對元，贠建民，張 炎，梁 琪

(甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070)

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)又稱β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，能夠催化β-D-半乳糖苷鍵發生水解，還具有轉半乳糖苷活性，在乳品、醫藥、分析、環境保護等方面都具有廣闊的應用前景，尤其有利于“乳糖不耐受癥”［1］。乳糖酶來源廣泛，可以從多種微生物、植物和動物體中獲得。利用微生物發酵法獲取乳糖酶的方法具有操作方便、生產效率高、適用于工業化生產等優點［2］。培養基的成分對于微生物發酵產酶有重要的影響，通常用于發酵培養基優化的方法有單因素實驗、正交實驗和均勻設計等［3］。Plackett-Burman法適用于從眾多的過程變量中快速、有效地篩選出最為重要的幾個因素［4］。Williams將其與隨機平衡實驗、部分因子實驗相比較，認為Plackett-Burman法在篩選實驗重要因子方面更為有效和準確［5］，另外還具有數據處理簡單、可適用于任意多個實驗因子等優點。Box-Behnken設計是一種適用于2～5個因素的響應面優化方法，采用該法可以建立連續變量響應面模型和回歸方程，同時可對影響因變量的各因子水平及其交互作用進行優化與評價，可快速有效地確定多因子系統的最佳條件，該法已經廣泛的應用于各類培養基以及發酵條件的優化實踐中［6-8］。本實驗以實驗室前期從甘肅省天祝牧區牦牛乳酸奶中分離的產乳糖酶菌株Enterobacter sp.SYA2［9］為研究對象，對Enterobacter sp.SYA2 的發酵條件和產酶的培養基進行了優化，以期為進一步擴大發酵實驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Enterobacter sp.SYA2 本實驗室分離并保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號CGMCC No:5251;鄰硝基苯酚(ONP) 南京化學試劑有限公司，分析純;5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal) 西安舟鼎國生物技術公司，色譜純;鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG) 科宏達生物技術有限公司，色譜純;種子培養基:乳糖10g/L、蛋白胨 10g/L、酵母膏 3g/L、NaCl 4g/L，p H6.5;基礎發酵培養基:乳糖 15g/L、蛋白胨 20g/L、酵母膏 3g/L、NaCl 4g/L、K2HPO41g/L，MnCl20.5g/L，pH6.5。

SW-CJH-1FD凈化工作臺 蘇州凈化設備廠;HG303-4電熱恒溫培養箱 南京實驗儀器廠;PB203-N電子天平 上海精密科學儀器廠;pHS-25數顯pH計 上海精密科學儀器廠;SUPRA 22K低溫高速離心機 韓國HANSON技術公司;UV-2450紫外可見分光光度計 日本島津公司;JY96-ПN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗酶液制備 將活化好的菌種接種于發酵培養基中，在一定條件下培養后取發酵液20mL，4℃、6000r/min離心20min，收集菌體并用0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.5)洗滌兩次，加入0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.5)至20mL，超聲破碎15min，4℃、12000r/min離心20min，上清液為粗酶液。

1.2.2 乳糖酶活力的測定 以ONPG為酶作用底物，參照文獻［10］并做適當修改。標準曲線:取6個100mL 容量瓶，標號為 1、2、3、4、5、6，分別移取 ONP儲備液 0.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0mL，各試管中加入25.0mL的Na2CO3溶液，再用磷酸鹽緩沖液定容至刻度，搖勻，溶液 ONP的濃度分別是 0.00、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mmol/L。以 1 號試管為空白管，于420nm處測定OD值。以ONP物質的量濃度為橫坐標，稀釋液的吸光度為縱坐標制作標準曲線。樣品測定:取0.5mL稀釋后的粗酶液，37℃下水浴5min，加入已預熱至37℃的含5mmol/L ONPG磷酸鹽緩沖液(pH6.5)1.5mL，37℃下水浴反應10min，然后立即加入3.0mL 0.5mol/L Na2CO3終止反應，于420nm下測定OD值，測定3次取平均值。空白為0.5mL加熱失活的酶液和1.5mL含5mmol/L ONPG磷酸鹽緩沖液(pH6.5)。一個酶活力單位定義(U)為:在37℃每分鐘水解釋放1μmolONP所需的酶量。

式中，X為乳糖酶活力(U/mL);C為標準曲線中對應的ONP的濃度(1μmol/mL);N為粗酶液稀釋倍數。

1.2.3 發酵條件的優化

1.2.3.1 發酵溫度對酶活的影響 將菌種接種于種子培養基中，37℃搖床培養12h制備種子液，然后將種子液按體積分數3%接種于裝液量為50mL/250mL三角瓶中，分別在 25、28、31、34、37、40℃下培養 24h，搖床轉速為175r/min，培養后收集菌體并測定酶活。

1.2.3.2 搖床轉速對酶活的影響 搖床轉速分別調節為 100、125、150、175、200、225r/min，其他條件不變，37℃振蕩培養24h后收集菌體處理后測定酶活。

1.2.3.3 裝液量對酶活的影響 基礎發酵培養基裝液量分別為20、30、40、50、60mL，其他條件不變，搖床轉速150r/min、37℃振蕩培養24h后收集菌體處理并測定酶活。

1.2.3.4 種子接種量對酶活的影響 將種子液分別以1%、3%、5%、7%、9%、11%接種于基礎發酵培養基中，其他條件不變，搖床轉速150r/min、37℃振蕩培養24h后收集菌體并處理并測定酶活。

1.2.3.5 種齡對酶活的影響 分別將培養6、8、10、12、14、16h的種子液以5%的接種量接種于基礎發酵培養基中，其他條件不變，搖床轉速150r/min、37℃振蕩培養24h后收集菌體處理并測定酶活。

1.2.4 發酵培養基優化 以乳糖酶酶活為響應值，在單因素基礎上采用兩步法進行優化:首先利用Plackett-Burman實驗設計篩選出對響應目標影響顯著的因素;然后利用Box-Benhnken設計進行優化實驗，通過實驗數據擬合得到二階響應模型，最終確定最佳發酵培養基，并進行驗證。

1.2.4.1 重要因素篩選實驗 應用Design-Expert軟件設計Plackett-Burman實驗，對基礎發酵培養基中的6個組分乳糖、蛋白胨、酵母膏、NaCl、K2HPO4、MnCl2和pH進行篩選。每個變量分別設定高低兩個水平，實驗因素水平見表1。

表1 Plackett-Burman實驗因素水平表Table 1 Level and code of variables for Plackett-Burman design

1.2.4.2 最陡爬坡實驗 以Plackett-Burman實驗篩選出的對發酵產酶影響顯著的因素為實驗因子，根據因素的正負效應確定爬坡方向和變化步長，進行實驗設計，具體見表5。

1.2.4.3 Box-Benhnken設計及響應面分析 以Plackett-Burman實驗篩選得到的對發酵產酶影響顯著的因素作為設計因子，以最陡爬坡實驗得出的最佳濃度為中心點，應用Design-Expert軟件設計Box-Benhnken實驗并進行響應面分析。

表2 Box-Behnken實驗因素與水平Table 2 Main fermentation conditions and levels for Box-Behnken design

2 結果與分析

2.1 發酵條件優化

2.1.1 發酵溫度對Enterobacter sp.SYA2產酶的影響

溫度是保證微生物生長和產酶的重要條件之一，它會影響發酵液的物理性質、菌株的代謝和生長速度等。

由圖1可以看出，在25～37℃的范圍內，酶活隨著溫度升高逐漸升高，37℃時酶活達到最高，37℃以后酶活逐漸降低，所以Enterobacter sp.SYA2發酵的溫度應控制在37℃左右。Hsu等人［11］研究表明，37℃為長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)CCRC15708最佳生長和產酶溫度。Batra［12］從喜馬偕爾邦的溫泉采樣分離出的凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)RCS3，發酵溫度為50℃時，產酶能力最好。

圖1 溫度對Enterobacter sp.SYA2產酶的影響Fig.1 Effect of temperature on production of Lactose from Enterobacter sp.SYA2

2.1.2 搖床轉速對Enterobacter sp.SYA2酶活的影響

轉速提高溶氧，同時能促進培養基中大分子物質的分散，促進菌體對其利用，降低高蛋白物質的黏度對菌體生長的抑制作用［13-14］。由圖2可知，靜止培養時，菌體幾乎不生長，酶活為零;隨著轉速的升高，乳糖酶活不斷升高，當超過150r/min后，乳糖酶活力逐漸下降。因此，該菌株發酵的最佳轉速為150r/min。

圖2 轉速對Enterobacter sp.SYA2產酶的影響Fig.2 Effect of rotation speed on production of Lactose from Enterobacter sp.SYA2

2.1.3 裝液量對Enterobacter sp.SYA2酶活的影響 發酵時裝液量直接影響著培養基中溶解氧量，進而影響產酶量。當裝液量較低時，由于發酵液中溶氧量增加，從而抑制了微生物代謝;但當裝液量過高時，溶氧量過低，不利于微生物生長代謝。250mL三角瓶中不同裝液量對乳糖酶活力的影響見圖3。結果顯示，當250mL三角瓶中裝液量為50mL時，酶活力最高，為7.24U/mL。

2.1.4 接種量對Enterobacter sp.SYA2酶活的影響接種量過小，會增長延滯期，對培養不利。接種量過大，菌體生長過快，代謝產物積累過多，從而造成菌體過早的衰老，停滯期越短，培養基消耗快，不利于產物的合成［15］。

由圖4可以看出，隨著接種量的增加，酶活力逐漸上升，當接種量為5%時，發酵液酶活為8.04U/mL，達到最大值，進一步加大接種量，產酶水平呈下降趨勢。

2.1.5 菌齡對Enterobacter sp.SYA2酶活的影響 由圖5可知，種齡對乳糖酶活影響較大，隨著菌齡的增加，酶活先升高后降低，當種子菌齡為8h時，酶活力最高，為9.02U/mL。

圖3 裝液量對Enterobacter sp.SYA2產酶的影響Fig.3 Effect of liquid volume in flask on production of Lactose from Enterobacter sp.SYA2

圖4 接種量對Enterobacter sp.SYA2產酶的影響Fig.4 Effect of inoculum size on production of Lactose from Enterobacter sp.SYA2

圖5 菌齡對Enterobacter sp.SYA2產酶的影響Fig.5 Effect of cell age on production of Lactose from Enterobacter sp.SYA2

2.2 培養基優化

2.2.1 重要因素篩選實驗 Plackett-Burman實驗設計及結果如表3所示，實驗結果分析見表4。

由表4可以看出，在α=0.05的顯著水平上，蛋白胨、乳糖、K2HPO43個因素對乳糖酶活的影響顯著，且影響均為正效應，影響程度為:蛋白胨＞乳糖＞K2HPO4，對這3個因素進一步優化。其余4個因素對發酵產脂肪酶的影響不顯著，NaCl為正效應，在后續優化實驗中取其高水平編碼對應的濃度;酵母膏、MnCl2和培養基p H均為負效應，在后續實驗中取其低水平編碼對應的濃度。

2.2.2 最陡爬坡實驗及結果 根據Plackett-Burman實驗結果設計，按一定的梯度增加蛋白胨、乳糖和K2HPO4在發酵培養基中的濃度。實驗設計及結果見表5。

表3 Plackett-Burman實驗設計及結果Table 3 Plackett-Burman test design and results

表4 Plackett-Burman實驗設計結果分析Table 4 The analysis of results for Plackett-Burman design

表5 最陡爬坡實驗及結果Table 5 Experimental design and results of steepest ascent path

由表5可知，隨著發酵培養基中蛋白胨、乳糖和K2HPO4濃度的增加，酶活先上升后下降，當培養基中蛋白胨、乳糖和 K2HPO4的濃度分別為 25、30、3.0g/L時，所對應的發酵液酶活最大，故以此條件作為Box-Benhnken實驗的中心點，進行下一步優化實驗。

2.2.3 Box-Benhnken實驗設計與響應面分析 綜合單因素實驗結果，根據Box-Behnken實驗設計的原理［16］，以乳糖酶活力為響應值 Y，選取乳糖 X1、蛋白胨X2、K2HPO4X5三個因素進行設計，Box-Benhnken實驗設計及結果見表6。

根據實驗結果，采用逐步回歸的方法進行二次回歸分析，得到相應的回歸方程式如下:

Y=15.81+0.45X1+0.49X2+0.49X5+0.17X1X2+0.51X1X5+0.22X2X5-1.20X12-1.41X22-1.62X52。對回歸模型進行方差分析，結果表明:該方程回歸顯著，模型的R2值為0.9649，說明回歸方程的擬合程度良好，失擬較小。由表7可以看出，方程中 X1、X2、X5、X1X5、X12、X22和X52對Y值的影響顯著，表明三個因素乳糖X1、蛋白胨X2、K2HPO4X3對酶活都有顯著影響，而且與響應值間不是簡單的線性關系。

表6 Box-Benhnken實驗設計及結果Table 6 Experimental design and result of Box-Benhnken

表7 二次多項回歸模型方程系數顯著性檢驗Table 7 Significance test of regressive coefficient of regression equation

三個因素之間的交互作用情況見圖8～圖10。圖8為當蛋白胨添加量位于中心水平時，乳糖濃度和K2HPO4濃度對發酵液酶活力影響的等高線圖，由圖可以直觀地看出乳糖濃度和K2HPO4濃度的交互作用較強。圖9為當K2HPO4濃度位于中心水平時，乳糖濃度蛋白胨濃度對酶活力影響的等高線圖，由圖可以看出乳糖濃度和蛋白胨濃度交互作用不大。圖10為當乳糖濃度位于中心水平時，蛋白胨濃度和K2HPO4濃度對酶活影響的等高線圖，由圖可以看出蛋白胨濃度和K2HPO4濃度的交互作用也不大。

采用Design-Expert軟件進行嶺脊分析(Ridge Analysis)，得出乳糖酶活力最大估計值為15.96U/m L，此時因素X1、X2、X5對應的實際濃度為:乳糖31.1g/L，蛋白胨26.0g/L，K2HPO43.0g/L。

2.2.4 驗證實驗 為檢驗響應曲面法所得結果的可靠性，采用上述優化發酵培養基進行驗證實驗，重復3次，測得的酶活平均值為15.95U/m L，與理論預測值基本一致，因此，基于響應曲面法所得的乳糖酶發酵培養基參數準確可靠。

圖8 乳糖與K2 HPO4濃度交互作用等高線圖Fig.8 Contour plot for interaction effect between lactase and K2 HPO4 on production of lactose

圖9 乳糖與蛋白胨濃度交互作用等高線圖Fig.9 Contour plot for interaction effect between lactose and peptone on lactose production

圖10 蛋白胨與K2 HPO4濃度交互作用等高線圖Fig.10 Contour plot for interaction effect between peptone and K2 HPO4 on lactose production

3 結論

3.1 采用單因素實驗對Enterobacter sp.SYA2產乳糖酶的發酵條件進行優化，得到最佳發酵條件為:培養溫度37℃，裝液量50mL/250mL，搖床轉速175r/min，接種量5%(V/V)，種齡8h。

3.2 在發酵培養基的優化實驗中，首先通過Plackett-Burman實驗篩選出對酶活影響顯著的3個因素即乳糖、蛋白胨、K2HPO4，然后以爬坡實驗結果為中心點，利用Box-Benhnken實驗設計并進行響應面分析，優化得出發酵培養基為:乳糖31.1g/L，蛋白胨26.0g/L，酵母膏 5.0g/L，K2HPO43.0g/L，NaCl 6.0g/L，MnCl20.5g/L，pH 6.5。利用該培養基進行發酵培養，測得的酶活平均值為15.95U/mL，與理論預測值基本一致，證明了模型的可靠性。

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