烏雞血酶解工藝條件的研究

黃龍鳥，董文賓

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021)

烏雞是我國(guó)所特有的聞名中外的珍貴家禽，集食、藥、補(bǔ)三大功能于一體。國(guó)內(nèi)大型烏雞養(yǎng)殖基地的年產(chǎn)烏雞量在2000萬羽左右，然而國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上大多是用烏雞的肉、骨、蛋來生產(chǎn)烏雞類產(chǎn)品，如十全烏雞精、烏雞天麻酒、烏雞白鳳丸、烏雞口服液、烏雞餅干、烏雞營(yíng)養(yǎng)面等，對(duì)烏雞血的利用還不是很充分［1-3］。烏雞血是一種很好的蛋白源，有學(xué)者分析了烏雞和白洛克雞血液中的非蛋白氮、谷丙轉(zhuǎn)氮酶(SGPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(SGOT)、乳酸脫氫酶(SLDH)、全血血糖、血清總脂、維生素C、胡蘿卜素、血鈣、血磷等十項(xiàng)生化指標(biāo)，并按均數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，烏雞血液中的SGPT、血糖、血清總脂、維生素C、胡蘿卜素含量均極顯著高于白洛克雞(p＜0.01);SLDH，血鈣含量顯著高于白洛雞(p＜0.05)，非蛋白氮、SGOT、血磷三者差異不顯著(p＞ 0.05)［4］。現(xiàn)有的傳統(tǒng)生產(chǎn)禽畜血粉工藝所生產(chǎn)的血粉，由于其消化率較差，血腥味比較大，色澤較深等問題使得血粉的利用率較低［5］，造成血液資源利用不充分，酶水解法是利用蛋白酶破壞血紅蛋白的空間結(jié)構(gòu)，使血紅素與珠蛋白脫離，釋放出的血紅素具有疏水性而聚集成顆粒被去除，該方法可有效解決血液在食品加工中出現(xiàn)色澤變黑的問題，同時(shí)通過酶解作用可以將蛋白質(zhì)進(jìn)一步降解成氨基酸、肽等，對(duì)其消化率有改善作用［6-10］。本實(shí)驗(yàn)通過酶解脫色制粉并研究烏雞血的酶解工藝條件，為開發(fā)適宜的烏雞血粉產(chǎn)品和綜合利用烏雞血資源提供新的方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮烏雞血 市售;AS1.398中性蛋白酶(酶活50000U/g) 西安沃爾森生物技術(shù)有限公司;胃蛋白酶(酶活1200U/g) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;木瓜蛋白酶(酶活500000U/g)、堿性蛋白酶(酶活200000U/g) 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;血紅素標(biāo)準(zhǔn)品 A lfa Aesar公司，純度99%;活性炭美國(guó)碳化公司上海辦事處。

PHS-3C精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器 常州國(guó)華電器有限公司;TDL-40B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;SP-752PC紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 新鮮烏雞血→預(yù)處理→超聲破碎→攪拌→調(diào)濃度→調(diào)pH→加酶→酶解反應(yīng)→滅酶→離心→酶解液→脫色→分離→冷凍干燥→成品

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 預(yù)處理 在新鮮烏雞血中按1∶9的體積比加入4%檸檬酸鈉抗凝，用紗布過濾，在2～4℃冷藏備用，長(zhǎng)期保存須在-18℃下密閉凍藏［9］。

1.2.2.2 超聲破碎

a.超聲破碎與機(jī)械破碎方式比較

烏雞血液超聲破碎程度的檢測(cè)采用溶血率來表示，取20m L新鮮烏雞血，在功率160W條件下，超聲處理10min(設(shè)置間歇時(shí)間5s，超聲時(shí)間5s，工作次數(shù)60次)，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算溶血率。

取20m L新鮮烏雞血，用電動(dòng)攪拌器機(jī)械攪拌10m in，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算溶血率。

b.取 20m L 新鮮烏雞血分別在 120、140、160、180、200、220、240W 條件下超聲破碎 10min，其他操作條件相同，測(cè)定溶血率，確定超聲功率［11］。

c.溶血率的計(jì)算公式:

溶血率(%)=(破碎前細(xì)胞總數(shù)-破碎后細(xì)胞總數(shù))/破碎前細(xì)胞總數(shù)×100

1.2.2.3 酶解 將經(jīng)過超聲破碎處理的烏雞血調(diào)成一定底物蛋白濃度，在一定溫度和pH下，加入適量的酶，用電動(dòng)攪拌器水浴保溫?cái)嚢杷庖欢ǖ臅r(shí)間，將完成水解的酶解液在85℃條件下滅酶10m in，離心后取上清液測(cè)定各指標(biāo)值。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取18mg經(jīng)105℃干燥至恒重的氯化高鐵血紅素標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1mol/L的NaOH溶液溶解并定容至100m L，即為180mg/L的血紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別吸取上述血紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0m L于100m L容量瓶中，用0.1mol/L NaOH溶液稀釋至刻度，搖勻。用0.1mol/L NaOH溶液做空白對(duì)照，于385nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值，以血紅素的濃度C(mg/L)為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)。標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 血紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Hemoglobin standard curve

1.3.2 水解度的測(cè)定方法［12］用甲醛滴定法測(cè)定氨基氮含量，按下式計(jì)算水解度:

水解度(%)=氨基氮/樣品中總氮量×100

1.3.3 蛋白含量和總氮含量測(cè)定 微量凱氏定氮法。

1.3.4 酶解工藝條件參數(shù)的確定 對(duì)溫度、酶加量、底物濃度、時(shí)間、pH進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將pH定為7.5，分別選取溫度、酶加量、底物濃度、時(shí)間4個(gè)因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以水解度，血紅素含量為指標(biāo)，其中，水解度指標(biāo)越大越好，血紅素含量指標(biāo)越小越好，采用L9(34)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。因素水平表見表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and level of orthogonal experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 抗凝處理

新鮮烏雞血中的凝血因子和凝血酶原在Ca2+存在時(shí)被激活，會(huì)使血液凝結(jié)成塊，因此新鮮烏雞血液需要經(jīng)抗凝處理，由于檸檬酸鈉能使Ca2+沉淀，并且沉淀物可直接進(jìn)入人體代謝，對(duì)人體無任何毒副作用，曾利平在研究抗凝劑添加量后，確定選用4%檸檬酸鈉作為抗凝劑效果最佳［9］。

2.2 超聲破碎條件的確定

超聲破碎與機(jī)械破碎的溶血率檢測(cè)如表2;不同超聲功率的溶血率檢測(cè)如表3。

表2 破碎方式對(duì)溶血率的影響Table 2 The influence of hemolysis rate on the broken way

表3 超聲功率對(duì)溶血率的影響Table 3 The influence of hemolysis rate on ultrasonic power

從表2可知，超聲破碎后的烏雞血的溶血率較之機(jī)械破碎的溶血率要高很多，因此選用超聲破碎作為烏雞血的破胞方式。從表3可知，當(dāng)超聲功率達(dá)到200W后，烏雞血的溶血率能達(dá)到最大值100%，因此選用200W作為烏雞血的超聲破碎功率條件。

2.3 酶解工藝條件的研究

2.3.1 酶解種類對(duì)酶解能力的影響 用微量凱氏定氮法測(cè)得新鮮烏雞血蛋白濃度為12.48g/100mL，分別采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶對(duì)烏雞血進(jìn)行酶解，各自酶解時(shí)，采用相同的酶加量、底物濃度和水解時(shí)間，而水解時(shí)的溫度和pH分別調(diào)至該酶水解作用的最佳溫度和p H。各種酶的酶解影響如圖2。

圖2 酶的選擇Fig.2 The choice of various enzymes

酶種類是一個(gè)非常重要的因素，不同來源的酶會(huì)對(duì)酶解作用產(chǎn)生不同的影響，準(zhǔn)確的選取一種蛋白酶進(jìn)行水解有著重要的作用，從圖2可以看出，以水解度為指標(biāo)，在不同時(shí)間取樣測(cè)定各自的水解度可看出，以上4種酶的酶解能力大小依次為:AS1.398中性蛋白酶＞堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胃蛋白酶;因此，本實(shí)驗(yàn)宜選取AS1.398中性蛋白酶作為酶解用酶。

2.3.2 酶解時(shí)間對(duì)酶解能力的影響 將經(jīng)過超聲破碎的烏雞血，調(diào)節(jié)其蛋白濃度為6%，pH7.5，酶加量為8000U/g，置于45℃恒溫水浴中電動(dòng)攪拌酶解，分別在2、4、6、8、10、12h 時(shí)取 10mL 酶解液測(cè)定水解度，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，隨著時(shí)間的增加，烏雞血的水解度也隨著增加，血紅素含量隨之減少，當(dāng)水解8h后，水解度變化較小，增速緩慢，血紅素含量達(dá)到最小值，盡管在12h時(shí)，水解度有所增大，但增值較小，且此時(shí)血紅素含量較高，所以本實(shí)驗(yàn)選取酶解時(shí)間8h為宜。

圖3 酶解最佳時(shí)間的確定Fig.3 The determination of the optimal hydrolysis time

2.3.3 溫度對(duì)酶解能力的影響 將經(jīng)過超聲破碎的烏雞血，調(diào)節(jié)其蛋白濃度為6%，p H7.5，酶加量為8000U/g分別在 35、40、45、50、55、60℃ 條件下酶解8h，測(cè)定各自的水解度，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，水解度增大，血紅素含量降低，當(dāng)達(dá)到45℃后，增大幅度減小，當(dāng)達(dá)到55℃時(shí)，水解度達(dá)到最大值，血紅素含量達(dá)到最低值，超過55℃，蛋白酶的活性減小，水解度有所下降。所以本實(shí)驗(yàn)選取酶解溫度55℃為宜。

2.3.4 酶加量對(duì)酶解能力的影響 將經(jīng)超聲破碎的烏雞血液，調(diào)節(jié)其蛋白濃度為6%，p H7.5，分別添加2000、4000、6000、8000、10000、12000U/g 的 AS1.398中性蛋白酶，置于55℃恒溫水浴中電動(dòng)攪拌酶解8h，測(cè)定各自的水解度，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，酶加量對(duì)酶解效果也有影響，在一定的范圍內(nèi)，酶解能力隨著酶加量的升高而增大，當(dāng)達(dá)到 8000～10000U/g時(shí)，水解度增大幅度緩慢，血紅素降到最低，超過10000U/g時(shí)，酶解能力反而有所下降，所以本實(shí)驗(yàn)選取酶加量為8000U/g。

圖4 酶解最佳溫度的確定Fig.4 The determination of the optimal hydrolysis temperature

圖5 酶加量對(duì)酶解能力的影響Fig.5 The influence of enzymatic hydrolysis ability on the amount of enzyme

2.3.5 底物濃度對(duì)酶解能力的影響 將經(jīng)超聲破碎的烏雞血，分別調(diào)節(jié)其底物蛋白濃度為4%、6%、8%、10%、12%，p H7.5，酶加量為 8000U/g，分別置于55℃恒溫水浴鍋中電動(dòng)攪拌酶解8h，測(cè)定各自的水解度，結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，底物濃度也是影響酶解效果的一個(gè)重要因素，底物濃度過高，水解不夠徹底，濃度過低，水解后的蛋白含量太低，經(jīng)濟(jì)上不劃算，當(dāng)?shù)孜餄舛仍?%～8%之間時(shí)，水解效果比較好，8%時(shí)達(dá)到最大值，超過8%，水解度開始下降，這可能是由于濃度過高產(chǎn)生了抑制酶解作用的產(chǎn)物所致。且超過8%，血紅素含量明顯增高，所以本實(shí)驗(yàn)選取底物濃度8%為宜。

2.3.6 p H對(duì)酶解能力的影響 將經(jīng)過超聲破碎的烏雞血，調(diào)節(jié)底物濃度為8%，分別調(diào)節(jié)p H為6.0、6.5、7、7.5、8.0、8.5，酶加量為8000U/g，在55℃的恒溫水浴鍋中電動(dòng)攪拌酶解8h，測(cè)定各自的水解度，結(jié)果見圖7。從圖7可以看出，pH的變化對(duì)酶解效果的影響較平緩，在pH7.5時(shí)水解效果最佳，超過7.5，水解度有所下降，這是由于水解過程中，游離出來的氨基酸羧基會(huì)使體系的pH下降。且pH在7～7.5之間時(shí)，血紅素含量較低。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選取pH7.5為宜。

圖6 底物濃度對(duì)酶解能力的影響Fig.6 The influence of enzymatic hydrolysis ability on the substrate concentration

圖7 pH對(duì)酶解能力的影響Fig.7 The influence of pH on enzymatic hydrolysis ability

2.3.7 酶解最佳工藝條件的確定 由正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析選取最佳的工藝條件，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of orthogonal test

從表4可以看出，對(duì)于水解度和血紅素含量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)而言，4個(gè)因素對(duì)酶解作用的影響由強(qiáng)到弱為均為:B(酶加量)＞A(溫度)＞C(底物濃度)＞D(時(shí)間)，但是各自的最佳組合不盡相同，對(duì)于水解度而言，最佳組合為B2A1C2D2，但對(duì)于血紅素含量而言，最佳組合為B2A2C3D2，根據(jù)綜合平衡法，對(duì)于本實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)指標(biāo)而言，因素A和C的優(yōu)次順序一致，因此根據(jù)降低能耗、提高效率的原則，對(duì)于因素A和C，選取A1、C2為宜，而對(duì)于因素B和D，兩者均在因素2時(shí)有最佳組合，所以選取B2、D2，因此本實(shí)驗(yàn)的最佳組合為B2A1C2D2，即烏雞血的最佳酶解工藝為:p H7.5，酶加量為8000U/g，溫度為45℃，底物濃度為8%，酶解時(shí)間6h，此條件下的水解度達(dá)到22.22%，血紅素含量為0.62mg/mL。

3 結(jié)論與討論

選取AS1.398中性蛋白酶對(duì)烏雞血進(jìn)行酶解，較之木瓜蛋白酶、胃蛋白酶及堿性蛋白酶，其效果更好;經(jīng)單因素和正交實(shí)驗(yàn)確定AS1.398中性蛋白酶酶解烏雞血的最佳工藝條件為:p H7.5，酶加量為8000U/g，溫度為45℃，底物濃度為8%，酶解時(shí)間6h，此條件下的水解度達(dá)到22.22%，血紅素含量為0.62mg/mL。

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