響應曲面法優化西瓜籽蛋白提取工藝

劉 野，鄒婷婷，宋煥祿

(北京工商大學食品風味化學北京市重點實驗室/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京100048)

西瓜是一種季節性很強并且產量很大的水果。據聯合國糧農組織統計，2007年全世界西瓜產量約為9300萬t，中國的產量約為6300萬t，約占全世界2/3［1］。西瓜的主要消費方式是鮮食，其中很小一部分用來加工。我國西瓜的加工主要是針對果肉，產品有西瓜汁、鮮切西瓜和西瓜霜等［2］。而對于西瓜的副產品(包括西瓜皮和西瓜籽)綜合利用卻較少。西瓜籽在西瓜中所占比例雖然較低，但由于西瓜產量巨大，仍然是一種極具開發潛力的資源。西瓜籽中含有豐富的蛋白質和油脂，其含量分別為30%和50%左右［3-6］。在西瓜籽蛋白質中，精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸是幾種含量較高的氨基酸［5］。其中亮氨酸是人體必需氨基酸，精氨酸是人體半必需氨基酸，因此西瓜籽蛋白質具有較高的營養價值［7-8］。本研究擬采用堿溶液等電點沉淀法對西瓜籽蛋白質進行提取，通過單因素實驗考察NaOH濃度、提取溫度、提取時間和液料比四個因素對提取率的影響，并采用響應曲面法對西瓜籽蛋白質提取條件進行優化，以期為工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西瓜(小鳳) 北京美廉美超市增光路店;氯化鈉 分析純，北京化學試劑二廠;牛血清白蛋白 美國Sigma公司;氫氧化鈉、硫酸、磷酸、正己烷、乙醇分析純，北京化工廠;考馬斯亮藍R-250 國藥集團化學試劑有限公司。

JYL-C012九陽料理機 九陽股份有限公司;JA5003電子天平 上海精密科學儀器有限公司;HJ-3數顯恒溫磁力攪拌器 常州國華電器有限公司;Q/CGT001-2000恒溫水浴鍋 山東鄄城華魯電熱儀器有限公司;DHG-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精密實驗設備有限公司;CR22G高速冷凍離心機 日本日立公司;22PC可見分光光度計 上海校光技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 西瓜籽脫脂 將晾干的西瓜籽用料理機磨碎，稱重。按照1∶10(W/V)的料液比，加入正己烷，常溫下用磁力攪拌器攪拌15min。去除液體部分，將固體部分在45℃的恒溫干燥箱內干燥6h后取出，置于冰箱冷藏室中保存待用。

1.2.2 西瓜籽蛋白的提取 稱取2g脫脂西瓜籽，放入250mL燒杯中，加入一定體積、不同濃度的NaOH溶液。將燒杯置于預先設定好溫度的恒溫水浴內進行蛋白質提取，提取過程要不斷攪拌。達到提取時間后，將上述混合溶液在10000r/min，4℃下離心15min。上清液即為西瓜籽蛋白粗提液。

1.2.3 西瓜籽蛋白濃度測定 西瓜籽蛋白質含量采用 Bradford 法進行測定［9］。

蛋白質標準曲線的制作:準確吸取0.1mg/mL標準蛋白溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8mL，用 0.9%NaCl溶液和4mL考馬斯亮藍染液補足到5mL。在595nm波長下測定溶液吸光值，以標準蛋白溶液濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。得到蛋白質標準曲線的回歸方程為:y=0.0128x-0.0021，R2=0.9967。

西瓜籽蛋白濃度的測定:取1mL稀釋20000倍的西瓜籽蛋白粗提液與4mL考馬斯亮藍染液混合，室溫下靜置3min，在595nm波長下測定吸光值，通過標準曲線計算蛋白濃度。

1.2.4 西瓜籽蛋白提取率的計算 根據標準曲線求出相當于樣品吸光度的蛋白含量，按下式求出西瓜籽中蛋白提取率。

其中:Y為西瓜籽蛋白的提取率(%);m1為粗提液中蛋白濃度(μg);m為脫脂西瓜籽的干重(mg);V1為測定用粗提液的體積(mL);V2為提取液的總體積(mL)。

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 提取溫度的影響 固定NaOH濃度為0.9%，提取時間為15min，液料比為50∶1，提取溫度設定 40、45、50、55、60℃五個水平梯度，考察提取溫度對西瓜籽蛋白提取率的影響。每個實驗點做三次重復。

1.2.5.2 NaOH濃度的影響 固定提取溫度為50℃，提取時間為15min，液料比為50∶1，NaOH濃度設定0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%五個水平梯度，考察NaOH濃度對西瓜籽蛋白提取率的影響。每個實驗點做三次重復。

1.2.5.3 提取時間的影響 固定提取溫度為50℃，NaOH濃度為0.9%，液料比為50∶1，提取時間設定5、10、15、20、25min 五個水平梯度，考察提取時間對西瓜籽蛋白提取率的影響。每個實驗點做三次重復。

1.2.5.4 液料比的影響 固定提取溫度為50℃，NaOH濃度為0.9%，提取時間為15min，液料比設定30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 五個水平梯度，考察液料比對西瓜籽蛋白提取率的影響。每個實驗點做三次重復。

1.2.6 響應曲面實驗 應用Design Expert 8.05軟件，根據Box-Behnken中心組合設計原理，以蛋白提取率為響應值，在單因素實驗結果的基礎上，綜合考慮實際生產的需要，對提取溫度、NaOH濃度、提取時間和液料比四個因素進行響應曲面實驗設計，因素水平見表1。每個實驗點做三次重復。

表1 響應曲面實驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取溫度的影響 由圖1可以看出，其他條件(NaOH濃度為0.9%，提取時間為15min，液料比為50∶1)固定時，西瓜籽蛋白質的濃度隨著溫度的升高而增加。在溫度為50℃時提取率最高(p＜0.05);而后隨著溫度升高西瓜籽蛋白質提取率逐漸降低。適當提高溫度使蛋白質分子熱動能增加而導致蛋白質結構的展開，使原先埋藏在蛋白質結構內部的非極性基團暴露，促進了集聚和沉淀作用，使提取率提高;但溫度過高會引起蛋白質變性，導致提取率降低［10-11］。因此，本實驗確定的最佳提取溫度為50℃。

圖1 提取溫度對西瓜籽蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of temperature on the extraction of watermelon seed protein

2.1.2 NaOH濃度的影響 由圖2可以看出，當其他條件(提取溫度為50℃，提取時間為15min，液料比為50∶1)固定時，西瓜籽蛋白質的濃度隨著NaOH濃度的增大呈先增大后減小的趨勢。在NaOH濃度為1.2%時，西瓜籽蛋白質的提取率最高(p＜0.05);在超過1.2%后，蛋白質的提取率會降低。由于堿液對蛋白質體系的平衡有影響，堿液的濃度在一定范圍內可以加快蛋白質的溶解并提高提取率;而堿液濃度過高會導致蛋白質多肽鏈中某些側鏈基團的解離程度發生變化，破壞了蛋白質分子空間構象，使蛋白質變性，提取率降低［12］。因此，本實驗確定的NaOH最佳濃度為1.2%。

2.1.3 提取時間的影響 由圖3可以看出，當其他條件(NaOH濃度為0.9%，提取溫度為50℃，液料比為50∶1)固定時，西瓜籽蛋白質的濃度隨著提取時間的延長呈現先增大后減小的趨勢。這是由于隨著提取時間的延長，溶液中的蛋白質出現凝聚沉淀，離心時蛋白質和殘渣一同被排除，從而降低了蛋白質的提取率［13-14］。在提取時間為10min時，西瓜籽蛋白質的提取率最高(p＜0.05)。因此，本實驗確定的最佳提取時間為10min。

圖2 NaOH濃度對西瓜籽蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of NaOH concentration on the extraction of watermelon seed protein

圖3 提取時間對西瓜籽蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of time on the extraction ofwatermelon seed protein

2.1.4 液料比的影響 由圖4可以看出，其他條件(NaOH濃度為0.9%，提取時間為15m in，提取溫度為50℃)固定時，西瓜籽蛋白質的濃度隨著液料比的升高而增大，在液料比為40∶1時提取率最高(p＜0.05);隨著液料比的增加，西瓜籽蛋白質提取率降低。因此，本實驗確定的最佳液料比為40∶1。

圖4 液料比對西瓜籽蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of liquid/solid ratio on the extraction of watermelon seed protein

2.2 響應曲面分析

以提取溫度、NaOH濃度、提取時間和液料比為四個可控工藝參數，以提取率為實驗指標，采用Box-Behnken設計方法來優化西瓜籽蛋白提取工藝條件，實驗設計方案及結果見表2。

利用Design Expert軟件，通過表3中實驗數據進行多元回歸擬合，獲得西瓜籽蛋白質提取率對編碼自變量提取溫度、提取時間、NaOH濃度、液料比的二次多項回歸方程:

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis results of regression and variance

由表3可以看出，本實驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性(pmodel＜0.0001)，其 R2為0.9150，這表明西瓜籽蛋白質的提取率有91.50%來源于所選變量，即提取溫度、NaOH濃度、提取時間和液料比。因此，此模型擬合情況較好，可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。回歸方程的各項方差分析結果表明，一次項和二次項都有顯著性因素，因此各實驗因素對西瓜籽蛋白質提取率的影響不是簡單的線性關系。所以，可以利用該回歸方程確定最佳工藝條件。

由回歸方程可知，提取溫度和NaOH濃度對西瓜籽蛋白質提取率有負效應，提取時間和液料比對其有正效應。一次項中，A、C對結果的影響均顯著(p＜0.05);B對結果影響極顯著(p＜0.01);D對結果影響不顯著(p＞0.05)。回歸模型中顯示了多項交互作用，其中除BC作用極顯著外(p＜0.01)，其它交互作用均顯著(p＜ 0.05)。二次項中，A2、B2、C2、D2均對結果影響極顯著(p＜0.01)。因此，在一定范圍內可調節提取溫度、NaOH濃度、提取時間和液料比，使西瓜籽蛋白質的提取率達到所需水平。

F值可以反映各因素對西瓜籽蛋白提取率的重要性，F值越大表明對提取率的影響越大，即重要性越大。表3中，FA=2.19;FB=7.96;FC=1.43;FD=0.42，即各因素對提取率影響程度的大小順序為:NaOH濃度＞提取溫度＞提取時間＞液料比。通過Design-Expert軟件分析，模擬得出提取率最高的優化組合為 A=49.14℃、B=1.14%、C=9.99min、D=40.34∶1，西瓜籽蛋白質提取率最高值為68.64%。

在回歸模型方差分析結果的基礎上，根據得到的回歸二次方程，利用Design Expert 8.05軟件作提取溫度、NaOH濃度、提取時間和液料比對提取率影響的響應曲面圖，分析兩個因素交互作用對西瓜籽蛋白提取率的影響。從圖5(a～f)看出，在每組交互作用的作用下，西瓜籽蛋白質提取率均有最大值，因此說明各組交互作用均對西瓜籽蛋白質提取率有影響。但各圖中兩因素對西瓜籽蛋白質提取率影響的大小只能通過方差分析得出，而不能僅依靠等高線的疏密度判斷。

通過軟件分析，得到西瓜籽蛋白提取的最佳工藝條件為溫度為49.14℃、NaOH濃度為1.14%、提取時間9.99min、液料比為40.34∶1，該條件下西瓜籽蛋白提取率預測值為68.64%。采取上述最優條件進行實驗，同時考慮到實際操作的情況，將西瓜籽蛋白質提取條件修正為提取溫度50℃、NaOH濃度1.2%、提取時間 10min、液料比 40∶1，實測提取率為68.48%。該值與理論最大值接近，說明采用響應曲面法優化西瓜籽蛋白提取工藝可行。

Wani等人采用響應曲面法優化研究得出當NaOH濃度為1.2%、液料比為70∶1、提取溫度為40℃、提取時間為15min時，西瓜籽蛋白的提取率達到最大值86.08%［15］。除液料比存在較大差距外，其他因素的條件與本研究較為一致，而西瓜品種的不同導致提取率的差異。另外，采用響應曲面法優化得到番茄籽蛋白的最佳提取工藝為:NaOH濃度1.2%、液料比 70∶1、提取溫度 60℃、提取時間5min［16］。提取條件的差異主要是由不同植物種子的結構、蛋白質的種類以及存在狀態決定。

圖5 各因素交互作用對西瓜籽蛋白提取率影響的響應曲面圖Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of various extraction conditions on the extraction yield of watermelon seed protein

3 結論

通過單因素實驗和Box-Behnken實驗設計以及響應面分析對西瓜籽蛋白提取工藝進行了優化，各因素對提取率的影響大小為:NaOH濃度＞提取溫度＞提取時間＞液料比。結合實際操作，確定提取西瓜籽蛋白質的最優條件是:提取溫度50℃、NaOH濃度1.2%、提取時間10min、液料比40∶1，西瓜籽蛋白質提取率最高值為68.48%。

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