甲胎蛋白異質體3、高爾基體蛋白73及熱休克蛋白27在原發性肝癌中的診斷價值

黃琳淋 李光迪

蘭州大學第二臨床醫學院，甘肅蘭州 730030

原發性肝癌（primary liver cancer）是我國常見的消化系統惡性腫瘤，由于起病隱匿，發展迅速，確診時多數患者已經處于癌癥晚期，治療效果不佳，死亡率高，每年有100 萬肝癌新患者，有11萬人死于肝癌，其全球發病率和死亡率分別列所有腫瘤的第5位和第3位[1]，發病率最高的國家大多在亞洲，其次在非洲等欠發達國家，大洋洲國家較低，美洲國家最低，且男性發病率高于女性，在我國，根據全國三次死亡回顧調查結果（1973-1975年；1990-1992年；2004-2005年） 肝癌在全部惡性腫瘤中的死亡順位分別為第3位、第2位、第2位，而農村地區發病率高于城市地區[2]，東南高于西北、華北和西南地區，東南沿海高于內陸[1]，嚴重威脅了人們的健康。目前除了影像學檢查外，肝癌的診斷和篩查主要依靠甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP），根據《2011年原發性肝癌診療規范》：對于AFP≥400 ug/L 超過1個月，或是≥200 ug/L持續2個月，排除妊娠、生殖腺胚胎癌和活動性肝病，就高度懷疑肝癌。但是AFP 對診斷肝癌的敏感性不高，只有30%～60%[3]，且在其他一些腫瘤患者中也有發現AFP 異常增高。因此，AFP 對于診斷原發性肝癌的應用十分受限。近年來，有學者通過大量的電泳實驗發現，原發性肝癌血清中都存在高爾基體蛋白73（GP73）、甲胎蛋白異質體3（AFP-L3）及熱休克蛋白27（HSP27），該研究通過定量檢測原發性肝癌、肝轉移癌、胃癌中三種蛋白的表達情況，并與甲胎蛋白做對比，為探討它們在原發性肝癌中的診斷價值,現對甘肅省蘭州大學第二醫院2011年10月—2012年5月住院患者及健康體檢者進行回顧性分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該研究共收集血清標本98例，來自甘肅省蘭州大學第二醫院2011年10月—2012年5月住院患者及健康體檢者，男60例，女38例，年齡24～77歲，中位數為52.5歲，其中原發性肝癌36例，肝轉移癌14例，胃癌20例，健康對照28例。原發性肝癌、肝轉移癌、胃癌患者均為治療前抽血，健康對照組排除了肝炎患者，肝功、腎功異常者。疾病診斷符合2011版“原發性肝癌診療規范”。

1.2 主要試劑及儀器

GP73 酶聯免疫試劑盒，AFP-L3 酶聯免疫試劑盒，HSP27 酶聯免疫試劑盒；model AT-858型自動酶標分析儀；Roche cobas 6 000 電化學發光儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本采集 抽取待測者清晨空腹靜脈血3 mL，室溫靜置2h，3 500 r/min，離心10 min。分離血清置-50 ℃冰箱保存。

1.3.2 GP74、AFP-L3、HSP27 測定 采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）測定，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.3 AFP 測定 采用Roche 發光試劑上機（Roche 2010 化學發光）定量檢測。

1.4 統計方法

采用SPSS 17.0 進行統計學分析。多組血清標本檢測呈偏態分布，用中位數（95%參考范圍）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney 檢驗。

圖1 AFP-L3 在各組中的表達情況

2 結果

2.1 各組血清標本AFP-L3、GP73、HSP27 的檢測結果及比較

2.1.1 各組的檢測結果 肝癌組、肝轉移癌組、胃癌組、正常對照組血清標本AFP、AFP-L3、HSP27、GP73 的表達水平（中位數及95%參考范圍），見表1。

2.1.2 各組間數據的總體比較 總體比較經Kruskal-Wallis 檢驗顯示，原發性肝癌組、肝轉移癌組、胃癌組、對照組間AFP-L3、HSP27、GP73 三種蛋白含量不全相同，差異有統計學意義（P<0.05（Chi-Square值：AFP-L3：62.862；HSP27：64.367；GP73：62.462）；原發性肝癌組的三種蛋白平均秩次明顯高于其他組。見圖1,2,3。

圖2 HSP27 在各組中的表達情況

圖3 GP73 在各組中的表達情況

表1 三種蛋白在各組標本中的表達水平

2.1.3 Mann-Whitney 檢驗兩兩比較 原發性肝癌組中AFPL3、HSP27、GP73 分別與其他三組比較，差異有統計學意義，結果如下，AFP-L3(U=3，Z=-5.38，P<0.05；U：48，Z=5.335，P<0.05；U=0，Z=-6.821，P<0.05），HSP27 （U=4，Z=-5.359，P<0.05；U=29，Z=-5.660，P<0.05；U=0，Z=-6.821，P<0.05）,GP73 （U=4，Z=-5.359，P<0.05；U=45，Z=-5.386，P<0.05；U：0，Z=-6.821，P<0.05）。肝轉移癌組、胃癌組及正常對照各組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 AFP-L3、GP73、HSP27 在原發性肝癌中的診斷價值

以各組三種蛋白水平繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線）。AFP-L3 診斷原發性肝癌的曲線下面積為0.977，HSP27 診斷原發性肝癌的曲線下面積為0.985，GP73 診斷原發性肝癌的曲線下面積為0.978。AFP 在臨界值為400 ng/mL時，診斷原發性肝癌的靈敏度為66.7%,特異度為96.7%。

2.3 AFP-L3、HSP27、GP73 與AFP 間的相關性分析

實驗時發現AFP-L3、HSP27、GP73 三種蛋白顏色的深淺與AFP的含量有明顯關系，為驗證是否具有相關性，采用Spearman檢驗，AFP 與AFP-L3、HSP27、GP73 的相關水平分別為：0.896、0.853、0.838，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.4 AFP-L3、HSP27、GP73 與乙肝表面抗原的相關性分析

原發性肝癌患者乙肝表面抗原表達情況為26例表面抗原陽性患者，10例表面抗原陰性患者，采用Spearman 檢驗，乙肝表面抗原（HBV-SAg）與AFP-L3、HSP27、GP73 的相關水平(r)分別為：0.119、0.176、0.176，雙側檢驗P值分別0.488、0.304、0.304，差異無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

當前，診斷原發性肝癌的實驗室指標主要依靠甲胎蛋白（AFP），但其靈敏度、特異度有限，學者們通過各種方法尋找原發性肝癌的特異指標，其中甲胎蛋白異質體（AFP-L3）、高爾基體蛋白73（GP73）、熱休克蛋白27（HSP27）是近年來的研究熱點。

根據AFP 分子存在糖鏈異質性，通過凝集素親和電泳可把AFP 異質體分成3個條帶，依據電泳遷移率大小，依次命名為AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3。AFP-L1 在良性肝病中占主要部分；AFP-L2 來自孕婦；AFP-L3 是由肝癌細胞產生[4]，因此AFP-L3的診斷靈敏度和特異度都應高于AFP。高爾基體蛋白73（GP73）是美國學者Kladney 發現的一種新的跨膜糖蛋白，在正常肝臟中，GP73 主要是在匯管區的膽管上皮細胞中表達，在其他肝細胞中不表達表達或是表達微弱[5]。有學者[6]分析肝癌患者血清中GP73 的靈敏度和特異度，都明顯好于AFP，在肝轉移癌組中尤為明顯。趙建忠[7]等應用酶聯免疫試劑盒檢測GP73，研究發現，與AFP-L3 相比，原發性肝癌組具有更高的GP73 陽性率，而在肝硬化和肝炎組中GP73 的陽性率低于AFP-L3，因此血清中GP73 含量可能是比AFP-L3 更好的一個分子標志物。熱休克蛋白27（HSP27）是低分子量熱休克蛋白家族成員，與藥物的抗性，細胞生長、凋亡，腫瘤的發生，轉移等功能密切相關的蛋白質，保護細胞免受應激損傷，參與細胞增殖分化，抑制細胞凋亡，參與癌癥的發生,在細胞凋亡時表達增加等，與腫瘤的惡性程度及預后有關[8-10]。Feng 等[11]結合了2-DE 和MALDI-TOF-MS/MS，分析了正常人、乙肝患者、HCC患者，鑒定出了8種差異蛋白，包括甲胎蛋白、熱休克蛋白27、叢生蛋白等，通過進步一蛋白免疫印跡驗證，HSP27 存在于90%HCC 中。

該研究結果顯示，AFP-L3、GP73、HSP27 在原發性肝癌中表達明顯高于肝轉移癌組、胃癌組及正常對照組，為評價三種蛋白對原發性肝癌的診斷價值，特做了ROC 曲線，HSP27 的曲線下面積最大。與甲胎蛋白相比，三種蛋白的診斷價值優于甲胎蛋白。由于只選擇了腫瘤標本，未選擇活動性肝炎、生殖系統腫瘤等AFP 出現假陽性的標本，引起本試驗特異度較高。該研究提示，AFP-L3、GP73、HSP27 與AFP 存在明顯的相關性，與某些研究不一致[12]，這可能與實驗方法有關，這有待進一步的研究證實。其次，AFP-L3、GP73、HSP27 與乙肝表面抗原無明顯相關，即是患者否患有乙肝對三種蛋白的原發性肝癌的診斷無明顯影響。

總之，甲胎蛋白異質體、高爾基體蛋白73、熱休克蛋白27 是診斷原發性肝癌的優秀的候選血清標志物，陽性率高，特異性好，操作簡單易行，在診斷原發性肝癌中具有較大的應用價值，研究前景廣闊。

[1]葉家才.原發性肝癌的流行病學特征及其危險因素[J].實用醫學雜志,2008，24(10)：1839-1841.

[2]陳建國.中國肝癌發病趨勢和一級預防[J].臨床肝膽病雜志，2012(4)：22-26.

[3]Uto,H.,S.Kanmura,Y.Takami,et al.Clinical proteomics for liver disease:a promising approach for discovery of novel biomarkers[J].Proteome Science,2010（8）：51-54.

[4]Li,D,T.Mallory,S.Satomura.AFP-L3:a new generation of tumor marker for hepatocellular carcinoma[J].Clin Chim Acta,2001，313(1-2):15-19.

[5]顧劍鋒,李明峰,顧樹南.GP73 與肝癌關系的研究進展[J].肝膽胰外科雜志，2011(20)：54-57.

[6]付超,齊軍,李學祥,等.高爾基體蛋白73(GP73)檢測在肝細胞癌中的應用價值[J].中國腫瘤,2010(8)：66-69.

[7]趙建忠,李智山,許東強,等.甲胎蛋白異質體3 和高爾基體蛋白73 檢測在原發性肝癌診斷中的臨床意義[J].中國實驗診斷學,2011(9)：106-108.

[8]王金龍,胡樹珍,潘東曉,等.血清HSP27 在原發性肝細胞癌早期診斷中的應用[J].解剖學研究,2011(3)：38-41，51.

[9]武凱,張生彬,敖利.熱休克蛋白HSP-27 在肝癌中作用機制的研究進展[J].內蒙古醫學雜志,2010(12):27.

[10]Romani,A.A,P.Crafa,S.Desenzani,et al.The expression of HSP27 is associated with poor clinical outcome in intrahepatic cholangiocarcinoma[J].BMC Cancer,2007（7）:232.

[11]Feng,J T,Y K.Liu,H Y.Song,et al.Heat-shock protein 27:a potential biomarker for hepatocellular carcinoma identified by serum proteome analysis.[J].Proteomics,2005，5(17):4581-4588.

[12]王壽明,高蕾,于樂成,等.甲胎蛋白異質體對肝癌診斷及療效評估價值研究進展.[J].實用肝臟病雜志,2011(6)：84-86.