金龜甲對蓖麻葉揮發物的觸角電位和行為反應

李為爭，楊 雷，申小衛，袁瑩華，原國輝，羅梅浩，郭線茹

(河南農業大學植物保護學院，鄭州 450002)

金龜甲對蓖麻葉揮發物的觸角電位和行為反應

李為爭，楊 雷，申小衛，袁瑩華，原國輝*，羅梅浩，郭線茹

(河南農業大學植物保護學院，鄭州 450002)

為了探明金龜甲偏愛選擇有害非寄主植物蓖麻的原因，應用觸角電位(EAG)儀和“Y”型嗅覺儀，分別測定了華北大黑鰓金龜、暗黑鰓金龜和銅綠麗金龜雌、雄蟲對5種蓖麻葉揮發物的觸角電位和選擇行為反應。EAG測定結果表明，3種金龜甲雄蟲對各處理揮發物的EAG反應值均比參照揮發物順-3-己烯-醇強。華北大黑鰓金龜對鄰苯二甲酸二丁酯和肉桂醛的EAG反應值相對較高，暗黑鰓金龜對苯甲醇的EAG反應值相對較高，銅綠麗金龜對鄰苯二甲酸二丁酯和苯甲醇的EAG反應值相對較高。選擇行為反應測定結果表明，當順-3-己烯-醇與其他揮發物配對測試時，華北大黑鰓金龜對鄰苯二甲酸二丁酯和肉桂醛2種蓖麻葉揮發物表現出明顯的選擇偏好，暗黑鰓金龜對蓖麻葉揮發物苯甲醇表現出明顯的選擇偏好，銅綠麗金龜則更偏好選擇蓖麻的綠葉氣味物質順-3-己烯-醇。總之，蓖麻葉的揮發性物質與引誘金龜甲偏愛選擇密切相關，且偏愛的揮發物因金龜甲的種類而異。

金龜甲；蓖麻；植物揮發物；觸角電位(EAG)；“Y”型嗅覺儀

精確定位寄主植物對植食性昆蟲的種群繁衍具有重要的生物學意義[1]。通常將寄主植物分為取食寄主和產卵寄主兩大類，植食性昆蟲的成蟲主要從取食寄主中獲得生長發育所需的營養物質，而在產卵寄主上繁殖其后代[2]。一般來說，植食性昆蟲的取食寄主和產卵寄主的種類十分有限，兩者的范圍往往也不完全一致。因此，植食性昆蟲適時尋找到合適的取食寄主和產卵寄主，是其生命歷程中尤為重要的環節[3]。在長期的進化過程中，植食性昆蟲已經發展出了一系列特殊的行為和生理機制來識別和選擇滿足自身及其后代需要的植物，通過其靈敏的嗅覺、視覺、觸覺和味覺系統感知寄主植物或非寄主植物的存在，從而做出趨向寄主植物或逃避非寄主植物的選擇行為[4]。然而，也有一些例外，有些植食性昆蟲會取食不適合自己的非寄主植物，或者將卵產在不適合其后代生存的非寄主植物上[5- 6]，這種“錯誤”選擇非寄主植物的現象有何特殊的生物學意義？

華北大黑鰓金龜Holotrichiaoblita、暗黑鰓金龜H.parallela和銅綠麗金龜Anomalacorpulenta是北方旱作區重要的農林地下害蟲，成蟲在植物或雜草的根際土壤中產卵，幼蟲(蠐螬)在土壤中取食植物的地下部分[7]。我國農民在生產實踐中發現，種植于田間的蓖麻Ricinuscommunis可大量誘殺多種金龜甲成蟲[8]，而從嚴格意義上說，蓖麻并不是金龜甲的寄主植物。進一步研究表明，3種金龜甲對蓖麻葉片均表現出比大豆、花生、甘薯等寄主植物明顯的選擇趨性[9- 11]。但蓖麻植株和葉片粗提物不僅對其幼蟲有觸殺毒性，而且成蟲少量取食后也表現出中毒反應[12]。其他相關研究也表明，蓖麻植株和葉片提取物對天幕毛蟲Malacosomaneustria和煙蚜Myzuspersicae[13]、斜紋夜蛾Prodenialitura和菜蛾Plutellaxylostella[14]、菜青蟲Pierisrapae[15]、草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda[16]和瓜絹螟Diaphaniaindica[17]等多種害蟲也具有觸殺毒性，其活性成分為蓖麻堿和毒蛋白，可作為新型的植物源殺蟲劑[18]，且蓖麻堿主要存在于蓖麻植株上部的新鮮葉片中[19]。金龜甲為什么會有這種趨向蓖麻葉片的“自殺行為”？金龜甲趨向這種有害非寄主植物的行為機制是什么？顯然，探明這些問題不僅對于深入了解植食性昆蟲與非寄主植物的關系，全面解析植食性昆蟲與植物的關系等具有重要的理論意義，而且可以為發展金龜甲行為調控技術和創制成蟲仿生行為調控產品，變地下害蟲的地下防治幼蟲為地上防治成蟲等提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

選擇華北大黑鰓金龜、暗黑鰓金龜和銅綠麗金龜3種金龜甲作為供試昆蟲。每年6—8月金龜甲成蟲發生高峰期，在河南農業大學科教園區農作物田采集成蟲，鑒定種類和區分雌雄后帶回室內分別飼養。飼養前取田間土壤過20目篩，烘干至恒重后均勻混入蒸餾水，將土壤含水量控制在18%—20%，然后放入l11 cm×w10 cm×h17 cm的養蟲盒內，土壤厚度10 cm左右。每盒放入成蟲約40頭，飼喂新鮮花生葉片。

1.2 供試揮發物

供試揮發物共5種。包括鄰苯二甲酸二丁酯(萊陽市雙雙化工有限公司)、肉桂醛(武漢盛世精細化學品有限公司)、順-3-己烯-醇(北京舒伯偉化工儀器有限責任公司)、苯甲醇(天津市科密歐化學試劑開發中心)和2-苯乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)，均是作者在前期研究中從蓖麻葉二氯甲烷索氏提取物中鑒定出的主要成分[20]。其中順-3-己烯-醇也是其他植物中常見的綠葉氣味，在昆蟲與植物關系中具有重要作用[21]，且已證明對多種金龜甲具有引誘活性[22- 24]。因此，本研究將順-3-己烯-醇作為觸角電位和行為反應測定的參照揮發物，另外4種揮發物作為處理揮發物。供試揮發物均為分析純，分別分散于石蠟油(天津市凱通化學試劑有限公司)中，配制成0.01 mol/L溶液，密封保存于4℃下備用。

1.3 觸角電位測定

采用觸角電位儀測定。觸角電位儀(MY-15)由微電極交/直流放大器(Syntech AC/DC UN-06)、刺激氣流控制器(Syntech CS-05)和微動操作儀(Syntech MP-15)組成，兩根Ag/AgCl電極分別作為參比電極和記錄電極。取健康活潑的金龜甲成蟲，選取一根觸角由基部切下，并切除觸角端部末梢，立即將離體觸角兩端用導電膠粘在兩根電極上，然后調試儀器，待基線平穩后進行測定。

測定時取處理揮發物20 μL均勻滴加在5 cm×4 mm長形濾紙條上，縱向對折后放入進樣管。然后對觸角進行氣味脈沖刺激，連續潔凈空氣的流量為80 mL/min，刺激氣體流量為30 mL/min，每次刺激時間為0.2 s，兩次刺激間隔30 s以上。隨機抽取供試揮發物樣品進行測試，均以20 μL石蠟油為對照，以順-3-己烯-醇為標準參照物。共測試3種金龜甲，每種金龜甲均按雌、雄蟲分別進行測試，每種揮發物測試10根觸角，同一揮發物在每根觸角上重復測試3次。

1.4 行為反應測定

采用“Y”型嗅覺儀測定。嗅覺儀主臂和側臂長均為20 cm，內徑4 cm，兩側臂夾角75°。主臂端與循環水真空抽氣泵連接，抽氣速度調節為600 mL/min。用硅膠管將兩側臂分別與盛放樣品的玻璃管、活性炭管串聯起來。兩個玻璃管分別放置滴有處理和對照揮發物的濾紙條，作為氣味刺激源。根據金龜甲晝伏夜出的活動習性，全部測定安排在20∶00—23∶00進行。測定室空氣潔凈，溫度為(25±2)℃，相對濕度為70%±5%，用紅光作為觀察光源。

測定時取處理揮發物20 μL滴加在上述長形濾紙條上，放入處理玻璃管內，對照玻璃管則放入滴加有20 μL石蠟油和順-3-己烯-醇的濾紙條，分別作為對照和參照。然后在距主臂端口3 cm處放入1頭饑餓24 h的金龜甲，連續觀察10 min。若金龜甲進入任一側臂內并停留1 min以上則記為已選擇，若滯留在主臂內則記錄為無選擇。共測試3種金龜甲，每種金龜甲均按雌、雄蟲分別進行測試，每種揮發物重復測試100頭金龜甲。

1.5 數據分析

用Syntech公司提供的軟件對不同處理的觸角電位反應值進行標準化校正，然后按下列公式計算觸角電位反應相對值：

按下列公式計算金龜甲對不同揮發物的選擇反應頻率：

采用Duncan′s多重比較法分析金龜甲對不同揮發物觸角電位反應的差異顯著性。用2測驗分析金龜甲對Y形管兩支臂樣品選擇頻率的差異，無效假設為兩支臂裝載的氣味化合物活性相當時，金龜甲進入兩支臂的概率相等。因自由度為1，故計算2值時需進行連續性矯正，公式如下：

2 結果與分析

2.1 金龜甲對不同揮發物的觸角電位反應

圖1 華北大黑鰓金龜對不同揮發物的觸角電位反應Fig.1 EAG responses of Holotrichia oblita to different volatiles 1: 鄰苯二甲酸二丁酯；2: 肉桂醛；3: 2-苯乙醇；4: 苯甲醇；5: 順-3-己烯-醇(參照); 同一性別的柱形圖上方不同小寫字母表示對不同揮發物的反應差異在0.05水平上顯著

華北大黑鰓金龜對蓖麻不同揮發物的觸角電位反應見圖1。從圖1可以看出，雌蟲對不同揮發物的EAG反應相對值均低于雄蟲，其中雌蟲對肉桂醛的EAG反應相對值最高，達146.01%，其次為鄰苯二甲酸二丁酯，達135.12%，兩者差異不顯著，但與其他處理的差異均達到顯著水平。雄蟲對鄰苯二甲酸二丁酯的EAG反應相對值最高，達200.34%，其次為2-苯乙醇，達168.43%，它們與苯甲醇和順-3-己烯-醇處理的差異均達到顯著水平。雌雄蟲平均相對EAG反應值最高的是鄰苯二甲酸二丁酯，其次是肉桂醛，而對兩種芳香族醇類化合物苯甲醇和2-苯乙醇的EAG反應則存在著性別差異，雄蟲的反應遠強于雌蟲。

暗黑鰓金龜對蓖麻不同揮發物的觸角電位反應見圖2。從圖2可以看出，雌雄蟲對同一揮發物的EAG反應相對值沒有明顯差別，但同一性別對不同揮發物的反應值卻明顯不同，苯甲醇能激發雌蟲和雄蟲最高的EAG反應相對值。其中，雌蟲對苯甲醇的EAG反應相對值達167.86%，與其他揮發物處理的差異均達到顯著水平，其次為肉桂醛(136.95%)；雄蟲對苯甲醇的EAG反應相對值為149.95%，與其他揮發物處理的差異均達到顯著水平，其次為肉桂醛(125.31%)和鄰苯二甲酸二丁酯(123.31%)。

銅綠麗金龜對蓖麻不同揮發物的觸角電位反應見圖3。從圖3可以看出，除了苯甲醇處理外，其他處理激發的雌蟲和雄蟲的觸角電位反應值之間差別不大，平均反應值最強的物質是鄰苯二甲酸二丁酯，雌雄蟲EAG反應相對值分別為144.45%和143.86%。此外，雄蟲對苯甲醇的反應值(143.70%)與鄰苯二甲酸二丁酯相當，且顯著強于雌蟲的反應值。其他處理間的反應值的差異則未達到顯著性水平。

圖2 暗黑鰓金龜對不同揮發物的觸角電位反應Fig.2 EAG responses of Holotrichia parallela to different volatiles

圖3 銅綠麗金龜對不同揮發物的觸角電位反應Fig.3 EAG responses of Anomala corpulenta to different volatiles

綜合比較供試揮發物可以看出，觸角電位活性最強的揮發物是蓖麻葉片中含量最高的鄰苯二甲酸二丁酯，尤其是雄蟲的選擇反應較強。綜合比較供試金龜甲可以看出，3種金龜甲雄蟲對各處理揮發物的EAG反應值均高于參照揮發物順-3-己烯-醇，雌蟲的EAG反應值則因金龜甲或揮發物的不同而有所變化，但絕大多數處理也高于參照揮發物順-3-己烯-醇，其中華北大黑鰓金龜雌雄蟲對供試蓖麻揮發物的觸角電位反應相對較強，而暗黑鰓金龜和銅綠麗金龜相對較弱。

2.2 金龜甲對不同揮發物的選擇行為反應

圖4 華北大黑鰓金龜對不同揮發物的行為反應Fig.4 Behavioral responses of Holotrichia oblita to different volatiles條形圖后的“**”和“*”分別表示兩配對測試樣品被選擇頻次的卡方測驗結果在1%和5%水平上差異顯著，“ns” 表示卡方測驗結果差異不顯著

圖5 暗黑鰓金龜對不同揮發物的行為反應Fig.5 Behavioral responses of Holotrichia parallela to different volatiles

圖6 銅綠麗金龜對不同揮發物的行為反應Fig.6 Behavioral responses of Anomala corpulenta to different volatiles

綜合比較金龜甲對5種蓖麻葉揮發物的選擇行為反應可以看出，不同金龜甲對不同揮發物的選擇偏好不同。就供試化合物的作用范圍而言，苯甲醇和鄰苯二甲酸二丁酯的引誘活性較為廣譜，肉桂醛僅對華北大黑鰓金龜表現出較強的引誘活性，2-苯乙醇的綜合表現最差。就金龜甲對不同供試揮發物的選擇偏好看，華北大黑鰓金龜對鄰苯二甲酸二丁酯和肉桂醛表現出明顯的選擇偏好，暗黑鰓金龜對苯甲醇表現出明顯的選擇偏好，而銅綠麗金龜則更偏好選擇綠葉氣味物質順-3-己烯-醇。

3 討論

植食性昆蟲表現出對有害非寄主植物的偏愛選擇是一類少見的現象。已有的報道多見于鱗翅目蛾類，如豆莢野螟Marucatestulalis喜歡將卵產在非寄主植物菽麻Crotalariajuncea上，但幼蟲取食菽麻后死亡率達75%以上，可在田間種植菽麻誘殺豆莢野螟[25]。歐洲山芥Barbareavulgaris葉片中含有三萜皂角苷[26]，是一種對菜蛾幼蟲有拒食活性的化合物[27]，但菜蛾雌成蟲卻喜歡選擇在這種非寄主植物上產卵[6]。香根草Vetiveriazizanioides在自然界很少遭受昆蟲侵害，因為香根草油具有較強的驅蟲活性[28]，但斑禾草螟Chilopartellus成蟲非常喜歡在這種植物上產卵，而幼蟲取食葉片后則大量死亡[29]。通常將這種偏愛選擇有害非寄主植物的現象稱為消極的偏愛與表演[30]，將這類誘集植物稱為致死性誘集植物，可直接用于害蟲的誘殺防治[31]。我國在田間種植蓖麻誘殺金龜甲已有數十年的歷史，最近研究表明，以蓖麻作為伴生植物可作為實施地下害蟲綠色防控的重要措施，但如何在田間科學配置蓖麻，還有很多問題需要深入研究[32]。

有關植食性昆蟲偏愛選擇有害非寄主植物的原因目前還不明確。一般認為，當非寄主植物與寄主植物上的化學信息或物理信息極其相似時，有些昆蟲會被這些非寄主植物的“假象”所“蒙騙”，從而做出“錯誤”判斷，將卵產在自己或其后代不適合生存的非寄主植物之上[33]。研究表明，蓖麻葉的揮發性物質與引誘金龜甲偏愛選擇密切相關，且偏愛的揮發物因金龜甲的種類而異，華北大黑鰓金龜偏愛選擇鄰苯二甲酸二丁酯和肉桂醛，暗黑鰓金龜偏愛選擇苯甲醇，銅綠麗金龜偏愛選擇順-3-己烯-醇，但究竟蓖麻中哪種或哪些揮發物起著關鍵的“蒙騙”作用還有待進一步探討。由于蓖麻對金龜甲具有毒性，金龜甲趨向蓖麻不是為了取食[9- 11]，初步推測金龜甲偏愛選擇蓖麻可能與其求偶、交配等繁殖行為有關。綜合分析已經鑒定出的齒爪鰓金龜屬Holotrichia雌性信息素可以發現，華北大黑鰓金龜雌性信息素的主要成份為甘氨酸甲酯和脯氨酸甲酯[34]，暗黑鰓金龜為L-異亮氨酸甲酯[35]，而蓖麻葉片揮發物中也含有包括鄰苯二甲酸二丁酯在內的大量酯類物質[36]。此外，本試驗結果還表明，雄蟲對蓖麻揮發物的選擇反應頻率明顯高于雌蟲，而雄蟲是感受性信息素的蟲態[8]，這是否意味著“性信息素誤導”是造成兩種鰓金龜偏愛選擇蓖麻的主要原因？有待進一步研究予以證實。麗金龜屬Anomala的雌性信息素多具有呋喃類的母核結構，如銅綠麗金龜雌性信息素的主要成份為5-十四烷基二氫2(3H)-呋喃酮[37]，因供試蓖麻揮發物中缺少該類物質，所以對銅綠麗金龜的引誘活性以順-3-己烯-醇最強，是不是因為蓖麻中這一綠葉氣味含量多于寄主植物所致，也有待進一步研究予以明確。至于金龜甲為什么表現出偏愛選擇蓖麻的“自殺行為”，這種冒險行為是否可以通過提高交配成功率得到補償？也值得進行深入研究。

觸角電位和嗅覺行為反應測定是評價化學物質對昆蟲生物活性的常用方法。前者測定的是昆蟲觸角對化學信號刺激的電生理反應，后者測定的是昆蟲對化學信號的嗅覺定向行為表現[38]。本研究綜合采用觸角電位和行為測定兩種技術，比較了3種金龜甲雌雄蟲對來自蓖麻的不同揮發物的反應，發現華北大黑鰓金龜和暗黑鰓金龜的電生理反應和行為選擇反應的測試結果基本一致，而銅綠麗金龜兩方面的測試結果一致性程度最低，除了雄蟲對苯甲醇的電生理反應和行為活性吻合外，其他測試均是電生理測試中揮發物活性強于參照，但行為測試卻不如順-3-己烯-醇的引誘力。這可能是因為觸角電位反映的是嗅覺感受器對特定化合物反應電壓的強弱，而最終輸出的行為反應則要經歷嗅覺受體至大腦嗅葉之間的神經編碼和投射、中樞神經系統對神經電生理信號的綜合評判以及大腦依據評判結果對運動器官的調控，這3個過程均有可能造成神經電生理信號的重新整合。因此，通常情況下用觸角電位技術初步篩選活性物質，用嗅覺儀評價這些活性物質的生物學作用。

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ElectroantennographicandbehaviouralresponsesofscarabbeetlestoRicinuscommunisleafvolatiles

LI Weizheng, YANG Lei, SHEN Xiaowei, YUAN Yinghua, YUAN Guohui*, LUO Meihao, GUO Xianru

CollegeofPlantProtection,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China

Holotrichiaoblita,H.parallelaandAnomalacorpulentaare important pests in the dry land areas of North China, which feed roots or stems of plants in larvae stage and leaves of variety of plants in adult stage. Most interestingly, three species all prefer to feeding on leaves ofRicinuscommunis, a non-host plant, despite that the extract ofR.communisleaf is toxic to their larvae and adults. In order to elucidate the mechanisms behind this phenomenon, in the present study, the electroantennographic and behavioural responses of the male and female adults of three scarab beetle species to five components ofR.communisleaf volatiles were tested using the electroantennogram (EAG) and a Y-typed olfactometer, respectively. The EAG bioassay showed that the relative EAG values of three species male scarab beetles were higher to four components, i.e., dibutyl phthalate, cinnamaldehyde, 2-phenylethanol and benzyl alcohol, than that to control volatile (Z)-3-hexene-1-ol, especially the males ofH.oblitaexhibited strong responses to dibutyl phthalate and 2-phenylethanol, with 200.34% and 168.43% relative EAG values, respectively. Corresponding females ofH.oblitaresponded strongly to cinnamaldehyde and dibutyl phthalate with the 146.01% and 135.12% relative EAG values, respectively. The relative EAG values ofH.parallelato benzyl alcohol arrived 149.95%(male) and 167.86%(female).A.corpulentaexhibited responses to dibutyl phthalate with about 144% the relative EAG values. The response ofA.corpulentamale to benzyl alcohol is strong with the 143.70% relative EAG values. The results of behavioural bioassay indicated the preference to volatiles derived fromR.communisis is species-dependent, that is,H.oblitaexhibited significant preferences to dibutyl phthalate and cinnamaldehyde, with the choice response percentages of 64% and 63% in females and 76% and 65% in males, significantly higher than that to (Z)-3-hexene-1-ol. Females and males ofH.parallelashowed significant preference to benzyl alcohol, with the 66% and 56% mean choice response percentages, respectively.A.corpulentawas most preferred to a green leaf volatile (Z)-3-hexene-1-ol, and the average choice response percentages of males and females to (Z)-3-hexene-1-ol were 88%, 87% and 89% in the controls of dibutyl phthalate, cinnamaldehyde and 2-phenylethanol, respectively. The results of comparison betweenR.communisvolatiles and the female-produced sex pheromones of the tested scarab beetle species, found thatR.communisleaves emitted abundant dibutyl phthalate, while the major components ofH.oblitafemale-produced sex pheromone were glycine methyl ester and proline methyl ester, and the major component ofH.parallelafemale-produced sex pheromone was methylL-isoleucinate. Therefore, “sex pheromone misleading” may possibly answer for the preferences of twoHolotrichiaspecies toR.communis. The green leaf volatile (Z)-3-hexene-1-ol may possibly be the main attractant ofA.corpulentatoR.communis.

scarab beetle;Ricinuscommunis; plant volatile; electroantennogram (EAG); “Y”-typed olfactometer

國家自然科學基金資助項目(31071972)；國家公益性行業(農業)專項資助項目(201203036)

2012- 07- 08;

2012- 11- 28

*通訊作者Corresponding author.E-mail: hnndygh@126.com

10.5846/stxb201207080959

李為爭，楊雷，申小衛，袁瑩華，原國輝，羅梅浩，郭線茹.金龜甲對蓖麻葉揮發物的觸角電位和行為反應.生態學報,2013,33(21):6895- 6903.

Li W Z, Yang L, Shen X W, Yuan Y H, Yuan G H, Luo M H, Guo X R.Electroantennographic and behavioural responses of scarab beetles toRicinuscommunisleaf volatiles.Acta Ecologica Sinica,2013,33(21):6895- 6903.