產(chǎn)類細(xì)菌素乳酸菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

陳宏偉 地力扎爾·阿扎提 張秀萍*

(1 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，阿拉爾新疆 843300)

(2 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾新疆 843300)

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一群形態(tài)代謝性能和生理學(xué)特征不完全相同的能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的通稱［1］。乳酸菌產(chǎn)品以其獨(dú)特的生物學(xué)功能呈現(xiàn)出前所未有的商業(yè)開發(fā)利用價(jià)值。乳酸菌產(chǎn)生具有抑菌或殺菌效果的有機(jī)酸、過(guò)氧化氧、雙乙酰和細(xì)菌素。乳酸菌細(xì)菌素以其安全、高效、無(wú)毒副作用和無(wú)抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)引起廣大從事食品防腐劑、飼料添加劑以及醫(yī)藥開發(fā)人員的研究熱情，成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［2－3］。本研究從苜蓿青貯、牛奶及奶酪、酸菜中的分離到4個(gè)可產(chǎn)生類細(xì)菌素菌株:戊糖乳桿菌、植物乳酸菌、戊糖片球菌、丙酸桿菌。并對(duì)其產(chǎn)類細(xì)菌素條件的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為其進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及培養(yǎng)基

苜蓿青貯、牛奶、酸菜、奶酪。分離株粗提發(fā)酵液。MRS、M17培養(yǎng)基，乳酸菌成套生化鑒定管(青島海博生物技術(shù)有限公司)，3%H2O2溶液。指示菌:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(塔里木大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌分離鑒定

分離培養(yǎng)將苜蓿青貯、牛奶、酸菜、奶酪制備成10倍梯度稀釋液，吸取10－4、10－5和10－6三個(gè)稀釋度的稀釋液1ml于滅菌平皿中，向平皿中倒入適量 MRS、M17瓊脂培養(yǎng)基混勻冷卻后，放置在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，挑取使培養(yǎng)基變黃的單菌落，在平板上劃線分離，經(jīng)革蘭氏染色，反復(fù)純化后保存斜面。

產(chǎn)乳酸的鑒定將分離菌株以接種于MRS、M17瓊脂液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48 h，得各菌株的發(fā)酵液。采用紙層析法定性測(cè)定乳酸［4］。

生化特性鑒定糖醇類發(fā)酵試驗(yàn)。將分離菌株以接種于生化鑒定管中，放置在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h后，鑒定細(xì)菌的屬、種。

1.2.2 產(chǎn)類細(xì)菌素菌株的篩選

發(fā)酵液的制備將分離株純培養(yǎng)物接種到MRS液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h，4℃離心15 min，上清液用濾膜過(guò)濾，除去菌體及其他雜質(zhì)，得到發(fā)酵濾液。

紙片法預(yù)測(cè)抑菌效果將50片直徑為6 mm無(wú)菌濾紙片浸泡于0.5 ml發(fā)酵液中，過(guò)夜干燥后，分別測(cè)試對(duì)指示菌的抑菌效果。

H2O2、乳酸作用的排除［5］設(shè)3個(gè)不同處理發(fā)酵濾液:發(fā)酵液原液組，發(fā)酵濾液不做任何處理，測(cè)試對(duì)指示菌的抑制效果。排H2O2作用組，發(fā)酵濾液中加入等量10 mg/mL的過(guò)氧化氫酶液，30℃水浴60 min后對(duì)指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。排乳酸作用組，將乳酸調(diào)無(wú)菌水pH與待測(cè)發(fā)酵濾液pH相同(pH=6.0)，分別測(cè)定乳酸水與發(fā)酵上清液對(duì)指示菌抑菌活性。

抑菌物質(zhì)效價(jià)的測(cè)定采用牛津杯平板擴(kuò)散法測(cè)試3個(gè)試驗(yàn)組發(fā)酵濾液對(duì)指示菌的抑制效果［6］。將指示菌涂布接種于MRS或M17瓊脂平皿中，將發(fā)酵濾液吸取100 μL加入到牛津杯中，30℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈的大小，并計(jì)算抑菌物質(zhì)效價(jià)。

抑菌物質(zhì)效價(jià)(Ru/mL)=(X－6)×1000/V

式中:X為抑菌圈直徑，mm;牛津杯直徑6 mm;V為樣品加入量，μL。

1.2.3 產(chǎn)細(xì)菌素條件的優(yōu)化

對(duì)生長(zhǎng)的主要影響因素碳源、氮源和緩沖因子，具體為蛋白胨:牛肉膏:酵母提取物的質(zhì)量比，碳氮總質(zhì)量分?jǐn)?shù)優(yōu)化進(jìn)行調(diào)節(jié)，A組為常規(guī)配方，蛋白胨:牛肉膏:酵母提取物的質(zhì)量比為2:2:1和碳氮總質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.5%，B 組為1:1:1，4%，C為2:1:1，和5%，D組為2:1:1和6%，設(shè)計(jì)三因素正交實(shí)驗(yàn)，以分離菌形成抑菌圈直徑的大小比較為評(píng)估依據(jù)，以得到優(yōu)化培養(yǎng)基。

表1 MRS培養(yǎng)基的成分變動(dòng)表(重量g/100ml)

1.2.4 類細(xì)菌素的理化和生物學(xué)特性

以金黃色葡萄球菌為指示菌，按參考文獻(xiàn)［7］中的方法測(cè)試分離株發(fā)酵液的pH值敏感性、熱敏感性、蛋白酶敏感性。溫度試驗(yàn)處理:分別在60℃、80℃、100℃加熱15 min。pH值試驗(yàn)處理:發(fā)酵液調(diào)pH 至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0。蛋白酶試驗(yàn)處理:加入胰蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶，在30℃溫育2 h之后，將pH值調(diào)至6.0;對(duì)照為未經(jīng)處理的發(fā)酵液。30℃溫育反應(yīng)，牛津杯法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離、鑒定

經(jīng)分離純化得到3株菌球菌，6株桿菌革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。通過(guò)紙層析試驗(yàn)，細(xì)菌發(fā)酵液與標(biāo)準(zhǔn)乳酸具有相近的Rf值0.72，可初步確定這9株細(xì)菌為乳酸菌。

結(jié)合細(xì)菌形態(tài)學(xué)及接觸酶試驗(yàn)特性，對(duì)9分離菌株進(jìn)行18種碳水化合物發(fā)酵利用特性研究，參考《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》［8］第8版及《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》［9］，認(rèn)為9株細(xì)菌是戊糖片球菌、木糖葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、模仿葡萄球菌(Staphylococci)、丙酸桿菌、異常芽孢桿菌(Abnormal Bacillus)、戊糖乳桿菌、植物乳酸菌、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、微小乳桿菌(Lactobacillus minor)。9株細(xì)菌生化特性結(jié)果見表2。

2.2 產(chǎn)類細(xì)菌素菌株的篩選

通過(guò)紙片法預(yù)測(cè)分離株發(fā)酵清液對(duì)指示菌的抑菌效果，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均表現(xiàn)出較好的抑制作用是戊糖乳桿菌、植物乳酸菌、戊糖片球菌、丙酸桿菌。分離株的抑制作用，可能是代謝物細(xì)菌素，也可能是H2O2、乳酸、乙酸等有機(jī)酸的存在，經(jīng)處理排除H2O2、乳酸的影響，將發(fā)酵上清液中和至pH值為6.0后，4株發(fā)酵液抑菌對(duì)金黃色葡萄球菌仍具有較強(qiáng)的抑菌活性，而乳酸抑菌作用不明顯，說(shuō)明發(fā)酵液中除產(chǎn)生有機(jī)酸等抑菌物質(zhì)外，還產(chǎn)生其他抑菌活性物質(zhì);經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理的發(fā)酵濾液的抑菌活性只有細(xì)微的變化，說(shuō)明發(fā)酵液的抑菌效果并不是H2O2產(chǎn)生的。4株發(fā)酵液抑菌對(duì)大腸桿菌的抑菌活性較弱。

表2 9株細(xì)菌生化特性

表3 不同處理發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌作用試驗(yàn)結(jié)果(直徑單位，mm)

表4 不同處理發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌作用試驗(yàn)結(jié)果(直徑單位，mm)

2.3 產(chǎn)類細(xì)菌素條件的優(yōu)化

經(jīng)過(guò)對(duì)分離株戊糖乳桿菌培養(yǎng)條件優(yōu)化后，在30℃(pH值為6.0)條件下，選擇C組碳氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、碳氮質(zhì)量比為3:2，MgSO4的添加量為0.07 g/100 ml，MnSO4的添加量為0.05 g/100 ml，0.2 ml/100 mlTween－80最有利于細(xì)菌素的產(chǎn)生，抑菌直徑可達(dá)18.2 mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的作用效果是A組的1.2倍，D組高濃度的碳源、氮源、金屬離子對(duì)細(xì)菌素的活性物質(zhì)的產(chǎn)生有一定的降低作用。

表5 不同配比MRS培養(yǎng)基對(duì)戊糖乳桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量的影響(直徑單位，mm)

2.4 類細(xì)菌素的理化和生物學(xué)特性

經(jīng)不同溫度、pH處理后，發(fā)酵上清液的在高溫時(shí)仍有較強(qiáng)的抑菌能力，在pH為2.0～8.0的環(huán)境中對(duì)指示菌均有抑制作用，在 pH 3.0，4.0，5.0時(shí)較 pH 2.0，pH，6.0，pH7.0 時(shí)抑菌直徑大。發(fā)酵上清液被胰蛋白酶、胃蛋白酶作用后，對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑制作用消失，說(shuō)明該抑菌物質(zhì)可能是蛋白質(zhì)類物質(zhì)。

表6 不同溫度、pH處理后的對(duì)金黃色葡萄球菌作用效果(直徑單位，mm)

3 討論

從不同生境中通過(guò)紙片法、牛津杯擴(kuò)散法篩選出4株可產(chǎn)生抑菌活性的乳酸菌，將發(fā)酵上清液在中和到pH7.0，用過(guò)氧化氫酶，胰蛋白酶、胃蛋白酶，高溫處理仍保持活性表明其本質(zhì)是蛋白質(zhì)，但未做蛋白質(zhì)的純化，故暫稱為類細(xì)菌素。80℃和100℃處理15 min后不能使其失活表明該物質(zhì)有耐熱的特性。發(fā)酵上清液在pH3.0～8.0范圍內(nèi)均有抑菌活性，在pH3.0～5.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，抑菌物質(zhì)對(duì)溫度不敏感，經(jīng)過(guò)蛋白酶的處理后抑菌活性有所降低。通常認(rèn)為細(xì)菌素的抗菌譜通常較窄［10］，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有較強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)革蘭氏陰性菌、酵母和霉沒(méi)有作用，而本實(shí)驗(yàn)獲得的分離株抗菌物質(zhì)對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌也具有一定抗菌活性，表明具有較寬的抑制譜，因而具有潛在的應(yīng)用前景。

細(xì)菌素的產(chǎn)生與生長(zhǎng)相聯(lián)系，有的細(xì)菌素在細(xì)胞剛開始生長(zhǎng)時(shí)即有產(chǎn)生，而有的細(xì)菌素則在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期或穩(wěn)定期才會(huì)產(chǎn)生［11］。培養(yǎng)基中碳氮比例對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)物合成的影響極為顯著，氮源過(guò)多則會(huì)使菌體生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，容易引起菌體的衰老和自溶;碳源過(guò)多則容易形成較低的pH值，不利于菌體生長(zhǎng)。Tween－80作為為一種乳化劑，可以降低菌體細(xì)胞與培養(yǎng)基接觸面之間的表面張力，從而改善細(xì)胞膜的通透性，減弱細(xì)胞對(duì)細(xì)菌素的吸附作用，使細(xì)菌素更多的釋放到培養(yǎng)基中，從而使細(xì)菌素產(chǎn)量增加。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基成分調(diào)整以優(yōu)化產(chǎn)類細(xì)菌素的條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明碳氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5%、碳氮質(zhì)量比為 3:2，適量的 MgSO4，MnSO4，0.2 ml/100 mlTween－80對(duì)細(xì)菌素的產(chǎn)生都有一定的促進(jìn)作用。

［1］龐會(huì)利，談重芳，蔡義民，等.乳酸菌分類鑒定方法的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)釀造，2009，207(6):1 －6.

［2］陳靜，張玉蒼，何連芳.乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素的研究進(jìn)展及其應(yīng)用前景［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(4):1925－1927.

［3］楊梅，陳霞，孫志宏.乳酸菌抗生素抗性的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2009，37(12):46 －49.

［4］劉曉蓉，鄧毛程，連曉蔚.腌肉中乳酸菌的分離選育［J］.中國(guó)釀造，2009，202(1):46 －48.

［5］劉曉蓉，范瑞，朱美娟.產(chǎn)類細(xì)菌素乳酸菌篩選及類細(xì)菌素的特性［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2009，37(6):8－11.

［6］王蔚淼.青貯飼料中乳酸菌的鑒定及生物學(xué)特性的研究［J］.萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù).安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006.

［7］張子健，劉玉恩，趙謙，等.植物乳桿菌c8—1產(chǎn)類細(xì)菌素的初步研究［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2010，38(1):15－18.

［8］R.E.布坎南.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第八版)［M］.科學(xué)出版社，1984:729－828.

［9］凌代文，東秀珠.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法［M］北京:中國(guó)輕工出版社，1999:5－13.

［10］周志江，韓燁，韓雪，等.從酸白菜中分離出一株產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸片球菌［J］.食品科學(xué)，2006，27(4):89－91.

［11］呂燕妮，李平蘭.戊糖乳桿菌31－1菌株產(chǎn)細(xì)菌素發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2005，32(3):13－16.