消斑固斑片多環節抑制和穩定易損斑塊的機制研究*

孫慧君

(河南中醫學院第二附屬醫院，河南鄭州450002)

研究表明:易損斑塊破裂和崩解是多因素、多環節作用的結果。從炎性反應、脂質浸潤、斑塊內新生血管等方面詮釋動脈粥樣硬化斑塊的易損性，對研究動脈粥樣硬化發生發展機制的探討有著重要作用，也為臨床上診斷動脈粥樣硬化易損斑塊、治療急性血管事件提供了思路和靶標［1］。消斑固斑片是課題組在易損斑塊“微型痰瘀毒“理論基礎上研制的有效方藥。該方藥能有效地抗炎、降脂、逆轉或消退AS斑塊和促進新生血管生成。本研究擬在前期研究基礎上，重點探討消斑固斑片對脂蛋白相關磷脂酶A2、血管內皮生長因子表達和斑塊內新生血管數的干預作用，探討其穩定易損斑塊的機制及藥效學基礎。

1 材料與方法

1.1 動 物

新西蘭純種白兔46只，體質量1.5～2.5 kg，由鄭州大學動物實驗中心提供，動物合格證號:2005－0012。

1.2 藥品、試劑與儀器

消斑固斑片由余甘子30 g、神曲15 g、山楂30 g等藥物組成，由河南中醫學院中藥制劑室制備，每粒0.46 g，相當于含生藥6.0 g。中國斑點蛙蛇毒由廣州蛇毒研究所提供，批號gz－03;血管內皮生長因子(VEGF)，單克隆抗體試劑盒(批號AZ－001)，高超敏C－反應蛋白(hs-CRP)(批號17320501)和脂蛋白磷脂酶A2(LP-PLA2)酶聯免疫試劑盒(批號CSBE06937Ca)，均由武漢博士德生物工程公司提供。LDZ5－2離心機，北京醫用離心機廠產品;MS1型快速組織均勻漿機，無錫沃信儀器有限公司產品;MP200－A型電子天平，上海精密儀器廠產品;病例圖像分析系統，江省捷達科技發展有限公司產品。

1.3 高脂飼料的制備

根據預實驗并參考文獻［2］加以改進，配方:豬油(占10%)、質量濃度1.5%膽固醇(占1.5%)、膽鹽(占 0.2%)、蛋黃粉(占 5.0%)、甲基硫氧嘧啶(占 0.2%)、基礎飼料(占83.1%)。

1.4 模型的建立、分組與給藥

經兔耳緣靜脈注射30 g/L戊巴比妥鈉(30μg/g)麻醉，無菌條件下做頸正中切口;分離右頸總動脈，兩端以動脈夾阻斷血流;1 mL注射器針頭刺入右頸總動脈，生理鹽水沖洗置換出血管內的血液后抽空血管腔;無菌注射器抽取液氮快速注入右頸總動脈(液氮在血管內即刻氣化為超低溫氮氣)，反復3次，歷時約2 min，以造成血管內皮凍傷;放開動脈夾恢復血流，壓迫止血;常規使用抗生素預防感染，術后高脂飼料喂養8周。于8周末，隨機抽取2只兔，病理切片證明As破裂斑塊形成。將造模成功兔隨機分為模型對照組和消斑固斑組兩組，每組10只。模型對照組用生理鹽水灌胃，消斑固斑組用消斑固斑片藥液1.2g/kg灌胃，兩組均按 2.0μL/g體質量給藥，2次/d，連續灌胃15 d。兩組均予高脂飲食至服藥結束。于處死動物前24，48 h參考Constantinides等［3］方法進行藥物觸發:中國斑點蛙蛇毒0.15μg/g腹膜下注射，30 min后，耳緣靜脈注射組織胺0.02μg/g，以促使斑塊發生實驗性破裂。

1.5 檢測指標

1.5.1 標本采集與處理

實驗開始第8周末及第10周末，禁食12 h以上，清晨空腹耳中動脈采血，離心，留取上清液，取出血清備用。另以斑塊破裂部位為中心，以3 mm厚度橫斷連續取材(包括病變部位上下端的正常動脈)，100 g/L福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色。

1.5.2 易損斑塊形態學指標

光學顯微鏡下觀察易損斑塊形態學變化，包括:血管外彈力膜面積(externaielastic membrance area，EEMA)，管腔面積(lumen area，LA)，斑塊面積(plaque area，PA)。

1.5.3 斑塊內新生血管數的變化

采用IMS型彩色病理圖像分析系統測量每1個切片斑塊的總面積，然后根據測量的多個指標，來計算斑塊的平均面積。動脈粥樣硬化斑塊區內小的棕色團，其中管腔直徑＞10μm者即為新生血管。計算400倍視野中新生血管數，隨機測定5個視野，取其均值作為該樣本的測定值。

1.5.4 斑塊內VFGF蛋白表達水平

采用免疫組化檢測斑塊內VFGF蛋白水平陽性表達。胞漿內出現棕黃顆粒沉著為VFGF陽性反應，用TIGER－920G細胞圖像分析儀測定5個視野bFGF陽性染色的平均光密度值(AOD)，取其均值以代表斑塊內VFGF蛋白表達的水平。

1.5.5 血清 LP-PLA2、hs-CRP

采用雙抗體兩步夾心酶聯免疫吸附法方法測定血清中LP-PLA2、hs-CRP水平的變化，按 ELISA試劑盒說明書操作。

1.5.6 TC、TG、HDL-C、LDL-C

采用酶法檢測TC、TG，磷鎢酸－鎂沉淀法檢測HDL-C、LDL-C。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0統計分析軟件處理。計量資料數據以均數()±標準差(s)表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差別有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組易損斑塊形態學指標對比

與模型對照組對比，消斑固斑組頸動脈EEMA、LA和PA面積縮小，差別有統計學意義(P＜0.05)，說明消斑固斑片具有較好消斑固斑作用。見表1。

表1 兩組易損斑塊形態學指標對比 s

表1 兩組易損斑塊形態學指標對比 s

注:與模型對照組對比，*P ＜0.05。

組 別 動物數 PA/mm2 EEMA/mm2 LA/mm2 8 5.89 ±3.29 14.45 ±1.30 8.3 ±4.24消斑固斑組 8 2.55 ±1.04* 9.48 ±1.96* 6.93 ±2.12模型對照組*

2.2 兩組易損斑塊VFGF蛋白表達水平和新生血管數量對比

與模型對照組對比，消斑固斑組斑塊內新生血管數量、VEGF蛋白陽性表達明顯降低，差別有統計學意義(P＜0.05)，說明消斑固斑片通過降低VEGF在粥樣斑塊中的表達，抑制斑塊內新生血管形成，達到穩定斑塊的作用。見表2。

表2 兩組易損斑塊VFGF蛋白表達水平和新生血管數量對比 ± s

表2 兩組易損斑塊VFGF蛋白表達水平和新生血管數量對比 ± s

注:與模型對照組對比，*P ＜0.05。

組 別 動物數 VEGF表達/AOD 每個視野內新生血管數量/個0.32 ±0.09 183.5 ±1.8消斑固斑組 8 0.18 ±0.04* 97.9 ±0.45模型對照組8*

2.3 兩組血清LP-PLA2、hs-CRP水平對比

模型對照組治療前后血清LP-PLA2變化明顯，差別有統計學意義(P＜0.05)，顯示炎癥反應在斑塊演變過程逐漸加重，表明斑塊破裂與血清LPPLA2具有相關性。消斑固斑組治療前后血清LPPLA2、hs-CRP變化不明顯，差別無統計學意義(P＜0.05);治療后血清 LP-PLA2、hs-CRP 相比，治療組LP-PLA2、hs-CRP降低明顯，P ＜0.05，說明固斑消斑片可通過抑制血清LP-PLA2、hs-CRP減少動脈粥樣硬化斑塊形成，防止破裂斑塊的作用。見表3。

表3 兩組血清LP-PLA2、hs-CRP水平對比

2.4 兩組 TC、TG、HDL-c、LDL-c對比

模型對照組血脂前后相比變化明顯(P＜0.05)，消斑固斑組血脂治療前后相比變化不明顯(P＞0.05);兩組治療后相比，治療組血脂降低明顯，差別有統計學意義(P＜0.05)，說明消斑固斑片降血脂效果明顯。見表4。

表4 兩組 TC、TG、HDL-c、LDL-c 對比 mmol·L－1，± s

表4 兩組 TC、TG、HDL-c、LDL-c 對比 mmol·L－1，± s

注:與模型對照組治療后對比，*P＜0.05;與本組治療前對比，#P＜0.05。

TC TG HDL-C LDL-C模型對照組 8 治療前組 別 動物數 時間4.8 ±0.79 3.08 ±0.47 2.01 ±0.5 3.49 ±0.75治療后 10.12 ±1.91# 7.08 ±0.53# 1.98 ±0.83# 5.88 ±0.23#消斑固斑組 8 治療前 4.89±0.47 3.12±0.32 2.02±0.23 3.75±0.41治療后 5.12 ±1.81* 4.69 ±0.12* 2.84 ±0.41* 3.90 ±0.57*

3 討論

易損斑塊是指那些不穩定和有血栓形成傾向的斑塊，主要包括破裂斑塊、侵蝕性斑塊和部分鈣化結節性病變。2003年Naghvi等［4］給出了易損斑塊的組織學定義和標準，主要的標準包括活動性炎癥、薄的纖維帽和大的脂質核心。研究表明:斑塊內新生的微血管與炎癥、纖維帽厚度、脂核大小一樣，被認為是目前斑塊破裂的最有利的獨立預測因子。炎性反應及炎性介質對不穩定斑塊的破裂起著至關重要的作用，也作為外因影響著板塊的穩定性。在晚期斑塊中，隨著纖維帽的形成，固有管腔來源的炎性細胞減少，但斑塊內形成的新生血管具有更強的介導炎性細胞趨化并進入斑塊的能力。因此，新生血管和炎性細胞之間可能存在著正反饋環路:一方面新生血管表達粘附分子并趨化聚集炎細胞進入斑塊，另一方面斑塊局部的炎細胞又產生生長因子并促進血管新生。二者互相促進，導致了斑塊的不穩定。目前中醫藥治療易損斑塊的臨床研究主要集中在消除、穩定易損斑塊和通過抑制易損斑塊的崩解而降低急性心腦血管疾病的發生［5－6］;在實驗研究方面，以探討中醫藥對AS抑制平滑肌細胞增殖、保護血管內皮細胞、調節血脂代謝、抗脂質過氧化等作用機制［7－8］為主。課題組基于痰瘀是斑塊形成病理基礎，毒邪是斑塊潰爛、崩解的導火索，因痰致瘀、痰瘀互結、變從毒起是易損斑塊病理演變的認識，采用化瘀降濁排毒法的代表方——消斑固斑片治療易損斑塊。消斑固斑片由余甘子、荷葉、山楂、澤瀉、大黃等組成。方中余甘子歸肝脾胃經，擅長滌化濁脂、消痰理氣，以除血中無形之脂，使濁降毒清，為君藥。荷葉有理氣散滯之功，通血活氣，使濁化瘀消，為臣藥。山楂味酸而甘，善消肉食油膩之積;澤瀉利水滲濕，使濁脂濕毒之邪從小便而走;大黃滌蕩腸胃，推陳出新，使濁瘀毒熱之邪從陽明而行。此3藥共佐君臣消斑固斑之功［9－12］。

本研究發現:消斑固斑片可明顯使總膽固醇、LDL-C降低，差別有統計學意義(P＜0.05)，此外，頸動脈的 EEMA、LA、PA較模型對照組變小(P＜0.05)，說明消斑固斑片具有較好的消斑固斑作用。VEGF是有促進血管內皮細胞有絲分裂的生長因子，在血管新生過程中具有重要意義，抑制VEGF在動脈粥樣斑塊中的表達可在一定程度上控制斑塊生長進程。消斑固斑組與模型對照組對比，斑塊內新生血管數量、VEGF蛋白陽性表達明顯降低(P＜0.05)，說明消斑固斑片通過抑制VEGF在粥樣斑塊中的表達，減少斑塊內血管新生，達到穩定斑塊的作用。血清LP-PLA2、hs-CRP活性能反映冠狀動脈粥樣硬化病變的嚴重程度。消斑固斑片可使血清LPPLA2、hs-CRP降低明顯，顯示消斑固斑片通過抑制血清LP-PLA2、hs-CRP來減少動脈粥樣硬化斑塊形成，防止破裂斑塊作用。綜上所述，消斑固斑片通過影響脂質代謝、炎癥反應和斑塊內血管新生，從多環節、多角度有效地逆轉或消除斑塊、防止斑塊破裂。此為臨床治療易損斑塊、降低急性血管事件發生，提供了思路和靶標。

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