黃瓜籽乙酸乙酯提取物對人成骨肉瘤細胞骨形態發生蛋白-2的影響

李 娜，潘 志，唐 燕，陳 新，宋 寧，張洪長*

(1.長春中醫藥大學研發中心,長春 130117；2.長春中醫藥大學藥學院，長春 130117)

·實驗研究·

黃瓜籽乙酸乙酯提取物對人成骨肉瘤細胞骨形態發生蛋白-2的影響

李 娜1，潘 志1，唐 燕1，陳 新2，宋 寧2，張洪長1*

(1.長春中醫藥大學研發中心,長春 130117；2.長春中醫藥大學藥學院，長春 130117)

目的 通過測定骨形態發生蛋白-2(BMP-2)的表達,探討黃瓜籽乙酸乙酯提取物(CSA)對人成骨肉瘤(MG63)細胞的活性的影響。方法 采用體外培養MG63細胞,給予CSA與MG6置于37 ℃，5%CO2飽和濕度培養箱中共同孵育48 h,MTT比色法檢測黃瓜籽提取物對細胞活性的影響；生化法檢測ALP含量，ELISA法定量檢測BMP-2的含量；免疫組化法測定BMP-2表達。結果 MTT法，CSA具有明顯促進MG63細胞活力(Plt;0.01);免疫組織化學染色法，CSA細胞中的BMP-2的表達量明顯高于空白組;CSA組ALP和BMP-2含量高于空白組(Plt;0.01)。結論 CSA對MG63具有保護作用，能夠有效的提高MG63細胞的生存率，其機制可能與促進BMP-2表達、升高ALP和BMP-2的含量有關。

黃瓜籽；ALP；BMP-2

黃瓜籽，異名哈利蘇，為葫蘆科黃瓜屬黃瓜CucumissativusL.的干燥成熟種籽。黃瓜籽具有續筋接骨、祛風的功效，主治骨折筋傷，風濕痹病[1]。現代研究證實，黃瓜籽具有促進人體骨骼再生的功效[2]，黃瓜籽多肽具有促進成骨細胞增殖、分化及抗骨質疏松作用[3]；在民間治療骨科疾病已有悠久的歷史，廣泛用于接骨壯骨及補鈣。本實驗利用ELISA法(HE染色及免疫組織化學方法測定)檢測堿性磷酸酶(ALP)和骨形態發生蛋白-2(BMP-2)的含量,免疫組化測定BMP-2的表達變化，探討黃瓜籽提取物促進骨折愈合在分子水平的作用機制，為黃瓜籽治療骨折的研究及開發治療骨折的新藥奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品制備 黃瓜籽提取物由長春中醫藥大學藥學院配制，將黃瓜籽粉碎成粗粉，采用仿生化提取法[4]，乙酸乙酯系統分離，得到有效部位(CSA)，配成濃度為1 mg/mL的檢測樣品溶液，置2 ℃冰箱備用。

1.2 細胞株、主要試劑及儀器 MG63細胞(購于吉林省腫瘤醫院)，胎牛血清、1640培養基和胰蛋白酶均購自于GibcoBRL公司。兔抗人BMP-2抗體、羊抗兔二抗購自于Pe-protech公司，DAB KIT顯色試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)。堿性磷酸酶(ALP)生化檢測試劑盒購于南京建成，BMP-2ELISA試劑盒購自美國Ramp;D公司。CO2培養箱購自Thermo公司，550型酶標儀購自美國BIO-RAD公司，Leica石蠟切片機，Leica攤片機，Leica包埋機均為德國Leica公司產品。

1.3 細胞培養 將MG63細胞置于含有10%胎牛血清和青鏈霉素各100 U/mL的1640培養基,在37 ℃、5%CO2的細胞培養箱內常規培養，待細胞長至80%融合時進行實驗，常規換液以維持細胞處于對數生長期狀態。

1.4 MTT法測定細胞活力 將MG63細胞接種于96孔板，每孔5×104/mL的細胞懸浮液200 μL、37 ℃、5%CO2培養24 h。當細胞完全貼壁生長后，吸棄培養液，分別加入不同質量濃度(10、100、500 μg/mL)的含藥培養基，以10%FCS-DMEM培養基為對照，繼續培養48 h。加入MTT(質量濃度為5 g·L)，每孔20 μL，置于培養箱孵育4 h后甩板，每孔加入150 μL DMSO使其顯色，37 ℃振動孵育10 min，使結晶溶解完全，置于酶標儀490 nm處檢測吸光度(OD值)。

1.5 生化指標檢測 調整細胞體積濃度約1×105/mL，接種于6孔板內。待細胞融合達到70%時，取MTT法篩選最佳給藥劑量進行給藥(100 μg/mL)，用PBS沖洗3次，加入0.2 mL裂解液，用刮刀將細胞刮下，移至EP管中，13 000 r/min離心30 min，收集上清按試劑盒說明要求，檢測細胞上清液中ALP和BMP-2的含量。

1.6 免疫組織化學法 調整細胞體積濃度1×105/mL，接種于6孔板(內置無菌蓋玻片)內。待細胞融合達到70%時，按照MTT法篩選最佳給藥劑量100 μg/mL給藥，用PBS反復洗滌3次，甲醇固定30 min,去除固定液，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX100作用20 min，加入BMP-2抗體(1∶50稀釋)，室溫作用1 h，二抗用PBS稀釋200倍，辣根酶標記。DAB顯色，蘇木素復染。于熒光倒置顯微鏡觀察。

2 結果

2.1 CSA對MG63細胞增殖作用(OD值)影響 CSA促成骨細胞增殖作用明顯，且當給藥質量濃度為100 μg/mL時，促增殖作用最為明顯；當給藥濃度為500 μg/mL時，對細胞增殖有抑制作用，說明濃度過大時有細胞毒性。提示黃瓜子微波制品的仿生化乙酸乙酯提取部位促骨細胞增殖效果最明顯。見表1。

2.2 CSA對ALP、BMP-2含量的影響 與對照組比較，給藥組的ALP含量均有升高(Plt;0.01)。由此可知，CSA均能夠有效的促進成骨細胞MG63對ALP、BMP-2的分泌，從而促進骨形成，起到防治骨質疏松的作用。見表2。

表1 CSA對MG63細胞增殖作用(OD值)影響

注：與對照組比較，#Plt;0.05。

表2 CSA對ALP，BMP-2含量的影響

注：與對照組比較，##Plt;0.01。

2.3 BMP-2免疫組織化學染色 BMP-2免疫組織化學染色顯示，CSA處置細胞后,給藥組細胞BMP-2呈明顯陽性,胞漿內分布著棕黃色顆粒表達增強。說明CSA具有保護MG63細胞的作用。見圖1。

A:對照組；B:CSA圖1 各組MG63中BMP-2的表達(免疫組織化學，×200)

3 討論

近年來，由于基因技術的發展應用，人們對骨折愈合的認識已從細胞生物學向分子生物學水平深化，并隨著分子生物學的不斷發展，已經認識到骨折愈合與多種生物因子有關[5-7]。隨著骨誘導理論的提出,人們發現BMP對未分化間充質細胞具有獨特的誘導其向成骨細胞方向轉化并進而形成新骨的作用[8-9]。骨折愈合主要受局部骨生長因子的調控[10-11]，中藥能有效地促進骨折愈合過程中BMPS的表達[12-13]，影響骨折愈合過程中BMP-2的合成，縮短骨折愈合的進程[14-16]，研究證明中藥能誘導生物體內BMP的合成。本實驗圍繞黃瓜籽有效成分的發現及其可能的對促進成骨細胞內BMP-2合成及其表達影響,進行了研究。MTT結果顯示，黃瓜子微波制品的仿生化乙酸乙酯提取部位對MG63細胞具有保護作用，能夠有效的提高MG63細胞的生存率；黃瓜籽乙酸乙酯提取部位具有增加成骨細胞內BMP-2表達的作用,促進ALP的合成，提示黃瓜籽促進骨折愈合的機制可能與促進BMP-2表達、升高ALP的含量有關，同時為黃瓜籽可促進成骨細胞內BMP-2的表達提供了佐證，也為中藥治療骨折的研究及開發治療骨折的新藥提供了理論基礎，值得進一步的研究。

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EffectofEthylAcetateExtractofCucumisSativusSeedonBMP-2ofMG63

LI Na1,PAN Zhi1,TANG Yan1,CHEN Xin2,SONG Ning2,ZHANG Hongchang1*

(1.Center of Research and Development,Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Changchun 130117,China;2.School of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

ObjectiveTo evaluate the expression of bone morphogenetic protein (BMP-2) of ethyl acetate extract of cucumis sativus seed on the Human Osteosarcoma MG63 cells.MethodMG63 cells with CSA were in vitro at 37 ℃ and 5% CO2saturated humidity incubator in common incubation 48 h.Cell viability was measured by MTT assay,and expression of BMP-2 was performed by the method of immunohistochemistry and ELISA.ALP was detected by Biochemical method.ResultCSA can obviously promote MG63 cells vitality(Plt;0.01) by MTT.The amount of the expression of BMP-2 in the CSA group wasobviously higher than that of blank group by Immunohistochemical staining.ALP and BMP-2 level of CSA group were higher than that of blank group (Plt;0.01).ConclusionCSA has a protective effect and can effectively improve the cell survival.Its mechanism may be related to promotion of the expression of BMP-2 and increase of the content of ALP and BMP-2.

cucumis sativus seed;ALP;BMP-2

R285.5

B

1003-5699(2013)12-1255-03

吉林省衛生廳科研課題(2009S012)；吉林省中醫藥管理局課題(2010-071)。

李 娜(1978-),女，藥學博士。研究方向：分子藥理學研究。

*

張洪長，電話：0431-86172082，電子信箱：zhc1961@hotmail.com。

2013-11-04)