射干麻黃湯對哮喘大鼠氣道重塑及TNF-α、IL-17的影響

曹 琿

(南京市胸科醫(yī)院 胸外科，南京 210029)

射干麻黃湯對哮喘大鼠氣道重塑及TNF-α、IL-17的影響

曹 琿

(南京市胸科醫(yī)院 胸外科，南京 210029)

目的 觀察射干麻黃湯對哮喘大鼠模型氣道重塑和TNF-α、IL-17的影響。方法 采用卵蛋白(OVA)聯(lián)合霧化吸入的方法建立哮喘大鼠模型，50只SD大鼠隨機分為5組。觀察治療后各組大鼠的TNF-α、IL-17含量以及大鼠氣道壁厚度。結(jié)果 地塞米松組及中藥組大鼠TNF-α(1.29±0.16,0.84±0.19)、IL-17(1.42±0.44，0.75±0.27)與模型空白組TNF-α(1.68±0.21)、IL-17(2.19±0.34)相比較明顯降低(Plt;0.01),且中藥組降低的幅度明顯大于地塞米松組(Plt;0.05)；在氣道壁厚度改善方面,中藥組的療效明顯好于地塞米松組,差異對比具有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)。結(jié)論 射干麻黃湯可以有效抑制哮喘大鼠的TNF-α、IL-17質(zhì)量濃度達到抑制炎癥的目的,從而緩解哮喘大鼠氣道重塑的進程。

喘證;氣道重塑;TNF-α;IL-17;射干麻黃湯；大鼠

支氣管哮喘是目前最常見的慢性肺系疾病之一，它是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞等多種炎性細胞、結(jié)構(gòu)細胞參與的氣道慢性炎癥疾病[1]，在哮喘發(fā)生的過程中不單單存在氣道炎癥，還會出現(xiàn)氣道結(jié)構(gòu)異常現(xiàn)象[2]。目前認為哮喘的發(fā)生是遺傳、環(huán)境、免疫等多因素共同導致氣管內(nèi)壁的慢性炎癥[3]，研究認為哮喘的發(fā)生主要是由于Th1/Th2之間的平衡狀態(tài)被打破,從而引發(fā)一系列哮喘的臨床癥狀[4-5]。由于炎癥學說的確立，抗炎治療得到了廣泛的應(yīng)用，但很多藥物只是單純的緩解癥狀，并不能有效逆轉(zhuǎn)哮喘的發(fā)生，同時長期應(yīng)用抗炎藥物還會帶來一系列的不良反應(yīng)，因此研究人員開始關(guān)注中醫(yī)藥在哮喘治療過程中的作用。我們研究發(fā)現(xiàn),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細胞介素-17(IL-17)在哮喘的發(fā)病及氣道重塑過程中發(fā)揮促炎的作用，射干麻黃湯是治療哮喘名方，本研究通過建立哮喘大鼠模型,觀察射干麻黃湯對哮喘大鼠血清中TNF-α、IL-17的影響及對氣道重塑的影響，探討射干麻黃湯治療哮喘的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠50只，體質(zhì)量(220±20) g，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.2 實驗藥物 射干麻黃湯組成:射干12 g，麻黃12 g，半夏12 g，紫菀9 g，款冬花9 g，細辛3 g，五味子3 g，生姜9 g，大棗3枚組成。所有中藥由江蘇省中醫(yī)院藥劑科提供,采用自動煎藥機煎取，濃縮為1 mL含生藥0.96 g(低劑量組)、3.84 g(高劑量組)2個組別；地塞米松針劑(5 mg/mL)，辰欣藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H37021969；0.9% NaCl溶液，南京小營藥業(yè)集團；水為重蒸餾高純水。

1.3 實驗試劑 卵蛋白(OVA)，美國Sigma公司;氫氧化鋁，上海鑫貴源化工有限公司;大鼠TNF-α、IL-17酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。

1.4 實驗儀器 冰凍切片機，浙江省金華科迪儀器設(shè)備有限公司;RM2135型石蠟切片機,德國LEICA公司；XL型全自動染色機，德國；SZ-93自動雙重純水蒸餾器,上海亞榮生化儀器廠；MPIAS-500彩色病理圖文分析系統(tǒng)；超聲霧化器，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備公司。

1.5 動物分組 50只SD大鼠隨機分為5組：正常組(A組)、模型空白組(B組)、地塞米松組(C組)、射干麻黃湯低劑量組(D組)、射干麻黃湯高劑量組(E組)。

1.6 動物模型制備 參照文獻[6-7]采用卵清蛋白注射和霧化吸入的方法制備大鼠支氣管哮喘模型。將1 mg OVA與200 mg氫氧化鋁溶于生理鹽水中，配成1 mL的混懸液。在實驗的第1、7、14 d采用腹腔注射OVA混懸液0.1 mL致敏。從第15天開始用1%OVA的生理鹽水霧化激發(fā)，隔日1次，每次30 min，共持續(xù)4周。當大鼠出現(xiàn)煩躁不安、呼吸加快、口唇紫紺、大小便失禁等癥狀，說明哮喘大鼠模型制備成功。第5周開始進行哮喘治療，C組大鼠給予地塞米松1 mg/(kg·d)灌胃治療，D組大鼠給予含生藥量0.96 g/(kg·d)的射干麻黃湯灌胃治療，E組大鼠予含生藥量3.84 g/(kg·d)的射干麻黃湯灌胃，A組及B組給予生理鹽水灌胃治療，持續(xù)治療20 d。

1.7 標本收集 在末次治療24 h后，處死大鼠。抽取大鼠股動脈血液2 mL，離心20 min(3 000 r/min)，分離血清后置于-80 ℃保存。按照ELISA試劑盒說明書進行檢測TNF-α、IL-17水平。處死大鼠后迅速取出左支氣管置于福爾馬林溶液中固定，進行蘇木精-伊紅(HE)染色，采用醫(yī)學圖像分析軟件測定支氣管壁的厚度，用以衡量氣道重塑的程度[8]。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠霧化吸入后行為改變情況 A組大鼠行為無任何異常表現(xiàn)，B組大鼠在激發(fā)10 min后出現(xiàn)呼吸加快加深、躁動不安，后期可見點頭呼吸、前肢縮抬，嚴重者可出現(xiàn)哮鳴音、皮膚紫紺等。C組、D組、E組大鼠均出現(xiàn)類似B組大鼠癥狀，但較B組減輕,大鼠行為改變程度為C組gt;D組gt;E組。

2.2 氣道形態(tài)學測定結(jié)果比較

2.2.1 WAt(管壁總面積)/Pbm(支氣管基底膜周徑)、平滑肌面積(WAm)/Pbm B、C、D、E組與A組相比氣道壁出現(xiàn)明顯增厚(Plt;0.01)；C、D、E組的氣道壁厚度明顯低于B組(Plt;0.05)；D、E組的氣道壁厚度明顯低于C組(Plt;0.05)，與A組相比氣道壁厚度無明顯差異(Pgt;0.05)。見表1。

2.2.2 內(nèi)壁面積(WAi)/Pbm B與A組相比氣道壁出現(xiàn)明顯增厚(Plt;0.05)；C、D、E組與A組相比氣道壁厚度無明顯差異(Pgt;0.05)。見表1。

注：與正常組相比，#Plt;0.01；與模型空白組相比，△Plt;0.01；與地塞米松組相比，◇Plt;0.05。

2.3 各組大鼠血液指標比較情況 B、C、D、E組的TNF-α、IL-17水平較A組明顯增高(Plt;0.01)，提示哮喘模型大鼠制備成功；C、D、E組的TNF-α、IL-17水平明顯低于B組(Plt;0.05或Plt;0.01)；D、E組的TNF-α、IL-17水平明顯低于C組，差異具有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)；D、E2組的TNF-α、IL-17水平之間無明顯差異(Plt;0.05)。見表2。

表2 各組大鼠治療后血液學指標變化情況 ng/mL

注：與正常組相比，#Plt;0.01；與模型空白組相比，△Plt;0.01；與地塞米松組相比，▲Plt;0.05。

3 討論

支氣管哮喘是以呼吸道高反應(yīng)性和慢性炎癥為主要特征的慢性呼吸道疾病，調(diào)查表明：支氣管哮喘的發(fā)病率約為18%，呈逐年上升的趨勢，每年大約有18萬人死于該病[9-10]。實驗研究[11]證明，哮喘最重要的免疫學異常是Th1/ Th2的失衡，主要體現(xiàn)在Th2細胞數(shù)目的增多及功能的亢進[11]。在支氣管哮喘動物模型或者是臨床哮喘患者中，都會出現(xiàn)Th1/Th2的失衡狀態(tài),此時兩者釋放的細胞因子都會導致哮喘特征性病理生理的變化。但是隨著研究的進一步深入,研究人員發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2失衡理論并不能完全解釋哮喘的進程，而Th17細胞亞群的發(fā)現(xiàn)恰恰彌補了這個缺陷，其分泌的IL-17與哮喘的發(fā)生有著密切關(guān)系。

IL-17是一種前炎癥因子，在機體中同時參與固有免疫和獲得性免疫反應(yīng)過程[12]。國外研究報道提示IL-17可以通過刺激間葉細胞來分泌二級前炎癥因子，使得中性粒細胞在炎癥區(qū)域內(nèi)聚集。[13]國外研究顯示IL-17可以明顯促進嗜酸性粒細胞的趨化，并使其釋放大量的細胞因子和化學介質(zhì),增強機體的炎癥反應(yīng)。[14]TNF-α是由單核巨噬細胞產(chǎn)生的一種多肽調(diào)節(jié)因子，其可以引起支氣管的高反應(yīng)性[15]，同時它還可像IL-17一樣聚集支氣管內(nèi)的炎癥細胞,產(chǎn)生多種炎癥遞質(zhì)。研究顯示，TNF-α可以上調(diào)血管內(nèi)皮細胞、嗜酸性粒細胞膜上表達的黏附分子，而這些黏附分子與氣道高反應(yīng)性的形成密切相關(guān)。

本實驗采用OVA聯(lián)合霧化吸入的方法復制哮喘大鼠模型,觀察射干麻黃湯與地塞米松對哮喘大鼠作用的差別。結(jié)果顯示，中藥組的黏膜、平滑基層以及氣道壁都出現(xiàn)顯著的增厚，說明射干麻黃湯可以抑制哮喘氣道重塑，改善患者臨床癥狀，且其劑量越高，抑制氣道重塑的效果越明顯。治療組哮喘大鼠TNF-α、IL-17的含量明顯低于模型空白組,治療后中藥組大鼠的炎癥因子已經(jīng)開始逐漸接近正常組,其降低TNF-α、IL-17的速度明顯快于地塞米松組。但是本實驗只是單純的從TNF-α、IL-17去探討了射干麻黃湯對哮喘大鼠的作用機理,對于射干麻黃湯的最佳作用劑量、加減作用、對于氣道重塑的影響的有效部位等更加復雜的問題，需要深入細致的研究。

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EffectofSheganMahuangDecoctiononAirwayRemodelingandExpressionofTNF-αandIL-17inAsthmaticRats

CAO Hui

(Department of Chest Surgery,Nanjing Thoracic Hospital,Nanjing 210029,China)

ObjectiveTo investigate the influence ofSheganMahuangDecoctionon airway remodeling and expression of TNF-αand IL-17 in asthmatic rats.MethodsRats were sensitized and challenged with ovalbumin(OVA) to establish the asthmatic model.Fifty SD rats were randomly divided into five groups.The expression of TNF-α and IL-17 in lung tissues were detected by immunohistochemistry.The paraffin embedded sections of lung tissue were observed.ResultsExpression levels of TNF-α and IL-17 in the epithelial cells of bronchi ofSheganMahuangDecoctiongroup were decreased obviously than in dexamethasone group(Plt;0.05) and in the control group(Plt;0.01).ConclusionRepeated exposure of allergen induces airway inflammation and remodeling.SheganMahuangDecoctionrestrain the increase of thickness of total airway wall and smooth muscle by inhibiting TNF-α and IL-17 degranulation in lung tissue.

bronchial asthma;airway remodeling;TNF-α;IL-17;SheganMahuangDecoction;rats

R285.5

A

1003-5699(2013)12-1258-03

曹 琿(1978-),男，大學本科，主治醫(yī)師。研究方向：心胸外科。

2013-04-25)